제 연구 그룹은 박테리아의 생합성 조립 라인의 기초 분자 생물학 및 생화학에 중점을 두고 있습니다. 우리의 목표는 박테리아를 조작하여 새로운 항생제를 만드는 것입니다. 우리는 이 작업을 교실에 도입하여 학생들에게 생명 공학의 최첨단 기술에 대한 실습 경험을 제공하는 데 열정을 쏟고 있습니다.
토포이소머라아제 기반 클로닝은 현재 Cal Poly 학부 분자생물학 교실에서 학생들에게 분자 클로닝을 소개하는 데 사용되고 있습니다. Gibson Assembly는 산업적으로 관련된 분자 복제 기술로 부상했으며, 학생들에게 적용 가능한 경험을 제공하기 위해 노력하고 있습니다. 분자 복제는 전통적인 학부 강의실에서 개념화하기 어려울 수 있는 기술입니다.
우리는 학생들이 실험을 설계하고 평가할 뿐만 아니라 진정한 연구 프로젝트에 기여할 수 있는 실습 실험실 모듈을 설계했습니다. 이를 통해 복제 과정과 작업 응용에 대한 이해도를 높일 수 있습니다. 분자 복제 기술을 활용한 다른 과정 기반 학부 연구 경험이 발표되었지만 적응형 Gibson 어셈블리 모듈은 포함되지 않았습니다.
우리는 이 과정 기반 학부 연구 경험에 대한 학습 결과를 측정하기 위해 모든 자료를 설계했습니다. 우리는 이것이 대학 수준의 분자 생물학 실험실에서 강사 평가 및 학생 교육을 개선하기 위해 쉽게 구현할 수 있는 과학 교육 도구 역할을 하기를 바랍니다. 먼저 게놈 DNA, 플라스미드 또는 합성 DNA와 같은 유전자 삽입에 대한 DNA 템플릿 소스를 결정합니다.
유전자 삽입물 및 벡터의 DNA 염기서열을 검색합니다. 원하는 삽입 염기서열과 벡터 염기서열을 Benchling에 새 DNA 염기서열 파일로 가져옵니다. 그런 다음 가져온 각 시퀀스를 Gibson 어셈블리 반응에 사용할 엽니다.
이제 화면 하단에서 Assembly Wizard 도구를 찾습니다. Assembly Wizard(어셈블리 마법사)를 클릭한 다음 Create New Assembly(새 어셈블리 생성)를 선택합니다. 제공된 옵션에서 Gibson을 선택하고 시작을 클릭하여 어셈블리를 시작합니다.
Vector Sequence 창에서 유전자 삽입의 3 프라임 말단에서 시작하여 원하는 종말점까지 벡터 백본 염기를 선택합니다. 선택한 후 화면 하단의 Backbone 탭을 클릭하고 Set Fragment를 선택합니다. Insert Sequence(삽입 순서) 창에서 어셈블리에 포함할 모든 삽입 베이스를 선택합니다.
선택한 후 화면 하단의 Insert 탭을 클릭하고 Set Fragment를 선택합니다. 유전자 삽입물이 여러 개 있는 경우 Assembly Wizard(어셈블리 마법사)의 오른쪽에 있는 더하기 버튼을 클릭합니다. Insert Sequence(삽입 순서) 창에서 어셈블리에 포함할 추가 삽입의 모든 베이스를 선택합니다.
선택한 후 화면 하단의 Insert 탭을 클릭하고 Set Fragment를 선택합니다. 모든 단편이 설정되면 어셈블리의 이름을 원하는 플라스미드 이름으로 바꿉니다. Assembly Wizard의 오른쪽에 있는 Assemble을 클릭합니다.
그런 다음 염기서열 폴더와 primer 폴더 모두에 대해 원하는 폴더 위치를 선택하고 Create를 클릭하여 재조합 플라스미드 염기서열을 조합합니다. 이제 조립된 플라스미드를 열고 Assembly History를 클릭하여 기본 플라스미드 맵과 플라스미드가 파생된 염기서열에 대한 개요를 확인합니다. Assembly Parameters 탭에서, 어셈블리를 위해 설계된 프라이머의 이름을 봅니다.
각 삽입물에 대해 두 개의 프라이머가 있고 프라이머 이름이 DNA 염기서열 파일 제목에서 파생되었는지 확인합니다. 프라이머 용융 온도와 제안된 어닐링 온도가 호환되는지 확인하십시오. 원하는 플라스미드에 대한 프라이머 설계가 완료되면 Assembly Wizard에서 Finalize를 클릭합니다.
DNA 템플릿과 함께 그래디언트 PCR 실험을 사용하여 최적의 어닐링 온도를 위해 인서트 및 벡터 특이적 프라이머 쌍을 모두 테스트합니다. 어닐링 온도가 결정되면 프라이머 용액, DNA 템플릿 및 학생의 PCR 반응에 필요한 시약의 부분 표본을 생성합니다. 먼저 강사로부터 PCR용 프라이머와 템플릿 DNA 솔루션을 구합니다.
여기에 표시된 시약을 사용하여 25마이크로리터 PCR 반응을 준비하여 원하는 DNA 염기서열의 선형 단편을 얻습니다. thermocycler에서 반응을 순환합니다. 어닐링 온도가 프라이머에 적합하고 확장 시간이 원하는 앰플리콘의 길이에 적합한지 확인하십시오.
다음으로, 아가로스 겔 전기영동을 통해 각 반응의 5마이크로리터를 분석합니다. 겔이 작동하는 동안 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하는 각 반응에 1마이크로리터의 DpnI 제한 효소를 추가합니다. 이 혼합물을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.
그런 다음 겔을 이미지화하여 PCR이 성공적이고 올바른 증폭이 이루어졌는지 확인합니다. 시판되는 PCR 정제 키트를 사용하여 성공적인 PCR 반응을 정제합니다. 후속 Gibson 어셈블리 계산에 사용하기 위해 마이크로볼륨 분광 광도계를 사용하여 정제된 PCR 산물의 농도를 측정합니다.
Gibson 어셈블리 반응 성분을 피펫팅합니다. 섭씨 50도에서 15분 동안 반응을 배양합니다. 반응이 배양하는 동안 화학적으로 유능한 대장균 세포를 얼음 위에서 해동시켜 변형시킵니다.
Gibson 어셈블리 반응의 2마이크로리터를 열 충격을 통해 화학적으로 적극적인 셀로 변환합니다. 형질전환된 세포 100마이크로리터를 두 개의 선택 플레이트에 피펫팅하고 멸균된 비드로 펴 바릅니다. 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다.
다음 날에는 접시를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 그런 다음 모든 플레이트의 콜로니를 세고 주어진 공식을 사용하여 변환 효율을 계산합니다. 마커를 사용하여 선택 플레이트에서 4개의 고유한 군체를 선택하고 학생의 이니셜과 숫자로 레이블을 지정합니다.
항생제가 들어있는 새 LB 한천 플레이트를 선택하여 사분면으로 나눕니다. 각 식민지의 약 절반을 사용하여 해당 사분면에 다시 정착하십시오. 선택을 위해 colony identification으로 표시된 튜브에 올바른 항생제 농도를 추가합니다.
그런 다음 5밀리리터 액체 LB 배양액에 선택된 4개의 콜로니 각각의 나머지 절반을 접종합니다. 액체 배양액을 섭씨 37도의 진탕 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하고 한천 플레이트를 동일한 온도의 정적 인큐베이터에서 배양합니다. 미니 전처리 키트를 사용하여 액체 배양에서 플라스미드 DNA를 분리합니다.
분리된 플라스미드 DNA의 농도를 마이크로리터당 나노그램 단위로 측정합니다. 분리된 플라스미드를 분석하기 위해 제한 분해 PCR 스크리닝을 설계한 후, 제한 분해 반응 또는 PCR 반응을 피펫팅합니다. 그런 다음 겔 전기 영동으로 결과를 분석합니다.
Gibson 어셈블리 모듈이 완료되면 학생 참가자에게 실험실 회의에서 객관식 사후 설문지를 작성하도록 요청합니다. 분석을 위해 사전 및 사후 설문지 응답의 모든 데이터를 결합하고 통계적 유의성을 평가합니다. 프로젝트 후 평균 콘텐츠 점수가 63.7%에서 80.4%로 크게 증가하여 분자 생물학 및 복제 개념에 대한 학생들의 이해도가 향상되었음을 나타냅니다.
평균 학기 신뢰도는 3.52에서 3.87로 크게 증가했으며, 분자 생물학 용어에 대한 학생의 이해도가 향상되었음을 보여주는 큰 효과 크기를 보여주었습니다. 실험 기법 수행에 대한 학생의 평균 자신감은 3.82에서 4.33으로 크게 증가하여 분자 생물학 기술에 대한 편안함이 향상되었음을 보여주었습니다. Gibson assembly라는 용어에 익숙하다는 응답의 수는 설문지 전에서 사후에 크게 증가했으며, 이 용어를 설명할 수 있는 응답자가 눈에 띄게 증가했습니다.
Gibson 어셈블리 기법 수행에 대한 자신감은 대부분의 응답에서 향상되었으며, 세션 전에는 중립적이거나 동의하지 않는 상태에서 세션 후에는 동의하거나 매우 동의하는 것으로 바뀌었습니다. 일반 생물학 주제에 대한 학생의 자신감은 통계적으로 유의미한 변화를 보이지 않았습니다. 반면, Gibson 어셈블리에 특화된 질문에 대한 신뢰도는 크게 증가했습니다.
