Mi grupo de investigación se centra en la biología molecular y la bioquímica fundamentales de las líneas de montaje de biosintéticos en bacterias. Nuestro objetivo es diseñar bacterias para producir nuevos antibióticos. Nos apasiona llevar este trabajo al aula, proporcionando a los estudiantes experiencia práctica en técnicas de vanguardia en biotecnología.
La clonación basada en topoisomerasa se utiliza actualmente en el aula de biología molecular de pregrado de Cal Poly para introducir a los estudiantes a la clonación molecular. Gibson Assembly se ha convertido en una técnica de clonación molecular industrialmente relevante, y estamos tratando de proporcionar a los estudiantes experiencias aplicables. La clonación molecular es una técnica que puede ser difícil de conceptualizar en un aula de pregrado tradicional.
Hemos diseñado un módulo de laboratorio práctico en el que los estudiantes diseñan y evalúan su experimento, además de contribuir a proyectos de investigación auténticos. Esto mejora su comprensión del proceso de clonación y las aplicaciones de su trabajo. Si bien se han publicado otras experiencias de investigación de pregrado basadas en cursos que utilizan técnicas de clonación molecular, ninguna incluye un módulo de ensamblaje de Gibson adaptable.
Hemos diseñado todos los materiales para medir los resultados de aprendizaje de esta experiencia de investigación de pregrado basada en cursos. Esperamos que esto sirva como una herramienta de educación científica fácilmente implementable para mejorar la evaluación de los instructores y la educación de los estudiantes en los laboratorios de biología molecular de nivel universitario. Para comenzar, determine la fuente de la plantilla de ADN para las inserciones de genes, como el ADN genómico, el plásmido o el ADN sintético.
Recupere las secuencias de ADN de las inserciones de genes y el vector. Importe las secuencias de inserción y las secuencias vectoriales deseadas en Benchling como nuevos archivos de secuencia de ADN. A continuación, abra cada secuencia importada para utilizarla en la reacción de ensamblaje de Gibson.
Ahora ubique la herramienta Asistente de ensamblaje en la parte inferior de la pantalla. Haga clic en Asistente para ensamblaje y, a continuación, seleccione Crear nuevo ensamblaje. En las opciones proporcionadas, seleccione Gibson y haga clic en Iniciar para comenzar el ensamblaje.
En la ventana Secuencia de vectores, seleccione las bases de la columna vertebral del vector a partir del extremo 3 primo de la inserción del gen hasta el punto final deseado. Una vez seleccionado, haga clic en la pestaña Backbone en la parte inferior de la pantalla y elija Establecer fragmento. En la ventana Secuencia de inserción, seleccione todas las bases de inserción que se incluirán en el ensamblaje.
Una vez seleccionado, haga clic en la pestaña Insertar en la parte inferior de la pantalla y elija Establecer fragmento. Si hay varias inserciones de genes, haga clic en el botón más en el lado derecho del Asistente de ensamblaje. En la ventana Secuencia de inserción, seleccione todas las bases de la inserción adicional que se va a incluir en el ensamblaje.
Una vez seleccionado, haga clic en la pestaña Insertar en la parte inferior de la pantalla y elija Establecer fragmento. Una vez que se hayan establecido todos los fragmentos, cambie el nombre del ensamblaje al nombre de plásmido deseado. Haga clic en Ensamblar en el lado derecho del Asistente para ensamblaje.
A continuación, seleccione la ubicación de carpeta deseada para la carpeta de secuencia y la carpeta de cebador, y haga clic en Crear para ensamblar la secuencia de plásmido recombinante. Ahora abra el plásmido ensamblado y haga clic en Historial de ensamblaje para ver un mapa de plásmido básico y una descripción general de las secuencias de las que se derivó. En la pestaña Parámetros de ensamblaje, vea los nombres de los cebadores diseñados para el ensamblaje.
Confirme que hay dos cebadores para cada inserto y que los nombres de los cebadores se derivan de los títulos de los archivos de secuencia de ADN. Asegúrese de que las temperaturas de fusión de la imprimación y las temperaturas de recocido sugeridas sean compatibles. Una vez completado el diseño del cebador para los plásmidos deseados, haga clic en Finalizar en el Asistente de ensamblaje.
Utilizando un experimento de PCR en gradiente con las plantillas de ADN, pruebe los pares de cebadores específicos del inserto y del vector para obtener temperaturas óptimas de recocido. Una vez que se hayan determinado las temperaturas de recocido, cree alícuotas de soluciones de cebadores, plantillas de ADN y reactivos necesarios para las reacciones de PCR para los estudiantes. Para comenzar, obtenga cebadores y soluciones de ADN molde para PCR del instructor.
Con los reactivos que se muestran aquí, prepare reacciones de PCR de 25 microlitros para obtener fragmentos lineales de las secuencias de ADN deseadas. Cicle la reacción en un termociclador. Asegúrese de que la temperatura de recocido sea adecuada para los cebadores y que el tiempo de extensión sea adecuado para la longitud del amplicón deseado.
A continuación, analice cinco microlitros de cada reacción mediante electroforesis en gel de agarosa. Mientras el gel está funcionando, agregue un microlitro de enzima de restricción DpnI a cada reacción que usó ADN plasmídico como plantilla. Incuba esta mezcla durante una hora a 37 grados centígrados.
A continuación, obtener una imagen del gel para confirmar que la PCR ha sido satisfactoria y que se ha logrado la amplificación correcta. Purifique cualquier reacción de PCR exitosa utilizando un kit de purificación de PCR disponible comercialmente. Mida la concentración de producto de PCR purificado utilizando un espectrofotómetro de microvolumen para su uso en cálculos posteriores de ensamblaje de Gibson.
Pipetea los componentes de reacción del ensamblaje Gibson. Incubar la reacción a 50 grados centígrados durante 15 minutos. Mientras se incuban las reacciones, descongele las células de Escherichia coli químicamente competentes en hielo para su transformación.
Transforme dos microlitros de la reacción de ensamblaje de Gibson en celdas químicamente competentes mediante un choque térmico. Pipetear 100 microlitros de las células transformadas en dos placas de selección y untar con perlas esterilizadas. Incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados.
Al día siguiente, guarde el plato a cuatro grados centígrados. Luego cuente las colonias en todas las placas y calcule la eficiencia de transformación usando la fórmula dada. Con un marcador, seleccione y etiquete cuatro colonias distintas en la placa de selección con las iniciales del estudiante y un número.
Tome una nueva placa de agar LB que contenga antibióticos para la selección y divídala en cuadrantes. Use aproximadamente la mitad de cada colonia para volver a trazar en el cuadrante respectivo. Agregue la concentración correcta de antibiótico a los tubos marcados con la identidad de la colonia para su selección.
A continuación, inocule un cultivo líquido de LB de cinco mililitros con la otra mitad de cada una de las cuatro colonias seleccionadas. Incubar los cultivos líquidos en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados durante la noche y la placa de agar en una incubadora estática a la misma temperatura. Aísle el ADN plásmido de los cultivos líquidos utilizando un mini kit de preparación.
Mida la concentración del ADN plasmídico aislado en nanogramos por microlitro. Después de diseñar una pantalla de PCR de digestión de restricción para analizar los plásmidos aislados, pipetee las reacciones de digestión de restricción o reacciones de PCR. A continuación, analice los resultados mediante electroforesis en gel.
Una vez que se complete el módulo de ensamblaje de Gibson, pida a los estudiantes participantes que completen el cuestionario de opción múltiple en la reunión de laboratorio. Combine todos los datos de las respuestas previas y posteriores al cuestionario para su análisis y evalúe su significación estadística. Después del proyecto, la puntuación media del contenido aumentó significativamente del 63,7% al 80,4%, lo que indica una mejor comprensión de los conceptos de biología molecular y clonación por parte de los estudiantes.
La confianza promedio en los términos aumentó significativamente de 3,52 a 3,87, con un tamaño de efecto grande que demostró una mejor comprensión de los términos de biología molecular por parte de los estudiantes. La confianza del estudiante promedio en la realización de técnicas de laboratorio aumentó significativamente de 3.82 a 4.33, mostrando una mayor comodidad con las técnicas de biología molecular. El número de respuestas que indicaron estar familiarizado con el término ensamblaje de Gibson aumentó significativamente del cuestionario previo al posterior, con un aumento notable en aquellos que podían explicar el término.
La confianza en la realización de la técnica de ensamblaje de Gibson mejoró con la mayoría de las respuestas, pasando de neutral o en desacuerdo antes de la sesión a estar de acuerdo o muy de acuerdo después. La confianza de los estudiantes en los temas de biología general no mostró cambios estadísticamente significativos. Por el contrario, la confianza en las preguntas especializadas de montaje de Gibson aumentó significativamente.
