Araştırma grubum, bakterilerdeki biyosentetik montaj hatlarının temel moleküler biyolojisi ve biyokimyasına odaklanmaktadır. Amacımız yeni antibiyotikler yapmak için bakteri mühendisliği. Bu çalışmayı sınıfa getirme ve öğrencilere biyoteknolojideki en son teknikler konusunda uygulamalı deneyim sağlama konusunda tutkuluyuz.
Topoizomeraz bazlı klonlama şu anda Cal Poly lisans moleküler biyoloji sınıfında öğrencileri moleküler klonlama ile tanıştırmak için kullanılmaktadır. Gibson Assembly, endüstriyel olarak ilgili bir moleküler klonlama tekniği olarak ortaya çıkmıştır ve öğrencilere uygulanabilir deneyimler sunmaya çalışıyoruz. Moleküler klonlama, geleneksel bir lisans sınıfında kavramsallaştırılması zor olabilen bir tekniktir.
Öğrencilerin deneylerini tasarlayıp değerlendirdikleri ve özgün araştırma projelerine katkıda bulundukları uygulamalı bir laboratuvar modülü tasarladık. Bu, klonlama süreci ve çalışmalarının uygulamaları hakkındaki anlayışlarını geliştirir. Moleküler klonlama tekniklerini kullanan diğer ders temelli lisans araştırma deneyimleri yayınlanmış olsa da, hiçbiri uyarlanabilir bir Gibson montaj modülü içermez.
Bu kurs temelli lisans araştırma deneyimi için öğrenme çıktılarını ölçmek için tüm materyalleri tasarladık. Bunun, üniversite düzeyindeki moleküler biyoloji laboratuvarlarında eğitmen değerlendirmesini ve öğrenci eğitimini geliştirmek için kolayca uygulanabilir bir fen eğitimi aracı olarak hizmet edeceğini umuyoruz. Başlamak için, genomik DNA, plazmit veya sentetik DNA gibi gen ekleri için DNA şablon kaynağını belirleyin.
Gen eklerinin ve vektörün DNA dizilerini alın. İstenen insert dizilerini ve vektör dizilerini yeni DNA dizi dosyaları olarak Benchling'e aktarın. Ardından, Gibson montaj reaksiyonunda kullanılmak üzere içe aktarılan her diziyi açın.
Şimdi ekranın altındaki Montaj Sihirbazı aracını bulun. Montaj Sihirbazı'na tıklayın ve ardından Yeni Montaj Oluştur'u seçin. Sağlanan seçeneklerden Gibson'ı seçin ve montajı başlatmak için Başlat'a tıklayın.
Vektör Dizisi penceresinde, gen ekinin 3 asal ucundan başlayarak istenen uç noktaya kadar vektör omurga tabanlarını seçin. Seçildikten sonra, ekranın altındaki Omurga sekmesine tıklayın ve Parçayı Ayarla'yı seçin. Insert Sequence (Sıra Ekle penceresinde), montaja dahil edilecek tüm kesici uç tabanlarını seçin.
Seçildikten sonra, ekranın altındaki Ekle sekmesine tıklayın ve Parçayı Ayarla'yı seçin. Birden fazla gen eki varsa, Montaj Sihirbazı'nın sağ tarafındaki artı düğmesine tıklayın. Insert Sequence (Ekleme Sırası penceresinde), montaja dahil edilecek ek kesici uç için tüm tabanları seçin.
Seçildikten sonra, ekranın altındaki Ekle sekmesine tıklayın ve Parçayı Ayarla'yı seçin. Tüm parçalar ayarlandıktan sonra, montajı istenen plazmit adıyla yeniden adlandırın. Montaj Sihirbazı'nın sağ tarafındaki Assemble (Birleştir) seçeneğini tıklatın.
Ardından hem dizi klasörü hem de astar klasörü için istenen klasör konumunu seçin ve rekombinant plazmit dizisini birleştirmek için Oluştur'a tıklayın. Şimdi birleştirilmiş plazmidi açın ve temel bir plazmit haritasını ve türetildiği dizilere genel bir bakışı görüntülemek için Montaj Geçmişi'ne tıklayın. Montaj Parametreleri sekmesinde, montaj için tasarlanmış astarların adlarını görüntüleyin.
Her insert için iki primer olduğunu ve primer adlarının DNA dizi dosyası başlıklarından türetildiğini onaylayın. Astar erime sıcaklıklarının ve önerilen tavlama sıcaklıklarının uyumlu olduğundan emin olun. İstenen plazmitler için astar tasarımı tamamlandıktan sonra, Montaj Sihirbazı'nda Sonlandır'ı tıklatın.
DNA şablonlarıyla bir gradyan PCR deneyi kullanarak, optimum tavlama sıcaklıkları için hem kesici uç hem de vektöre özgü primer çiftlerini test edin. Tavlama sıcaklıkları belirlendikten sonra, öğrenciler için PCR reaksiyonları için primer çözeltileri, DNA şablonları ve gerekli reaktiflerin alikotlarını oluşturun. Başlamak için, eğitmenden PCR için primerler ve şablon DNA solüsyonları edinin.
Burada gösterilen reaktifleri kullanarak, istenen DNA dizilerinin doğrusal parçalarını elde etmek için 25 mikrolitrelik PCR reaksiyonları hazırlayın. Reaksiyonu bir termocycler'da döngüye sokun. Tavlama sıcaklığının astarlar için uygun olduğundan ve uzatma süresinin istenen amplikonun uzunluğuna uygun olduğundan emin olun.
Daha sonra, agaroz jel elektroforezi yoluyla her reaksiyonun beş mikrolitresini analiz edin. Jel çalışırken, plazmit DNA'yı şablon olarak kullanan her reaksiyona bir mikrolitre DpnI kısıtlama enzimi ekleyin. Bu karışımı 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.
Ardından, PCR'nin başarılı olduğunu ve doğru amplifikasyonun elde edildiğini doğrulamak için jeli görüntüleyin. Piyasada bulunan bir PCR saflaştırma kiti kullanarak başarılı PCR reaksiyonlarını saflaştırın. Sonraki Gibson montaj hesaplamalarında kullanılmak üzere bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak saflaştırılmış PCR ürününün konsantrasyonunu ölçün.
Gibson montaj reaksiyonu bileşenlerini pipetleyin. Reaksiyonu 50 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Reaksiyonlar inkübe edilirken, kimyasal olarak yetkin Escherichia coli hücrelerini dönüşüm için buz üzerinde çözdürün.
Gibson montaj reaksiyonunun iki mikrolitresini ısı şoku yoluyla kimyasal olarak yetkin hücrelere dönüştürün. Dönüştürülen hücrelerin 100 mikrolitresini iki seçim plakasına pipetleyin ve sterilize edilmiş boncuklarla yayın. Plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, plakayı dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra tüm plakalardaki kolonileri sayın ve verilen formülü kullanarak dönüşüm verimliliğini hesaplayın. Bir işaretleyici kullanarak, seçim plakasında öğrencinin baş harfleri ve bir numara ile dört farklı koloniyi seçin ve etiketleyin.
Seçim için antibiyotik içeren yeni bir LB agar plakası alın ve kadranlara bölün. İlgili kadrana dayanmak için her koloninin yaklaşık yarısını kullanın. Seçim için koloni kimliği ile etiketlenmiş tüplere doğru antibiyotik konsantrasyonunu ekleyin.
Daha sonra, seçilen dört koloninin her birinin diğer yarısı ile beş mililitrelik bir sıvı LB kültürünü aşılayın. Sıvı kültürleri gece boyunca 37 santigrat derecede çalkalanan bir inkübatörde ve agar plakasını aynı sıcaklıkta statik bir inkübatörde inkübe edin. Bir mini hazırlık kiti kullanarak plazmit DNA'yı sıvı kültürlerden izole edin.
İzole edilmiş plazmit DNA'nın konsantrasyonunu mikrolitre başına nanogram cinsinden ölçün. İzole edilmiş plazmitleri analiz etmek için bir kısıtlama özeti PCR ekranı tasarladıktan sonra, kısıtlama sindirim reaksiyonlarını veya PCR reaksiyonlarını pipetleyin. Daha sonra sonuçları jel elektroforezi ile analiz edin.
Gibson montaj modülü tamamlandıktan sonra, öğrenci katılımcılardan laboratuvar toplantısında çoktan seçmeli anket sonrası anketi doldurmalarını isteyin. Analiz için anket öncesi ve sonrası yanıtlardan elde edilen tüm verileri birleştirin ve istatistiksel anlamlılıklarını değerlendirin. Proje sonrasında, ortalama içerik puanı %63,7'den %80,4'e önemli ölçüde artmıştır, bu da öğrencilerin moleküler biyoloji ve klonlama kavramlarını daha iyi anladığını göstermektedir.
Ortalama terim güvenirliği 3.52'den 3.87'ye önemli ölçüde artmıştır ve büyük bir etki büyüklüğü, öğrencilerin moleküler biyoloji terimlerini daha iyi anladığını göstermiştir. Ortalama bir öğrencinin laboratuvar tekniklerini gerçekleştirme konusundaki güveni 3.82'den 4.33'e önemli ölçüde artmış ve moleküler biyoloji tekniklerinde daha fazla rahatlık göstermiştir. Gibson montajı terimine aşinalık gösteren yanıtların sayısı, anket öncesinden sonrasına önemli ölçüde arttı ve terimi açıklayabilenlerde kayda değer bir artış oldu.
Gibson montaj tekniğinin uygulanmasına duyulan güven, çoğu yanıtla birlikte gelişti, oturumdan önce tarafsız veya aynı fikirde olmamaktan sonra aynı fikirde olmaya veya kesinlikle aynı fikirde olmaya geçti. Öğrencilerin genel biyoloji konularına olan güveni istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik göstermedi. Buna karşılık, özel Gibson montaj sorularına olan güven önemli ölçüde arttı.
