私の研究グループは、細菌の生合成アセンブリラインの基礎分子生物学と生化学に焦点を当てています。私たちの目標は、細菌を操作して新しい抗生物質を作ることです。私たちは、この研究を教室に持ち込み、学生にバイオテクノロジーの最先端技術の実践的な体験を提供することに情熱を注いでいます。
トポイソメラーゼベースのクローニングは、現在、Cal Polyの学部分子生物学教室で、学生に分子クローニングを紹介するために使用されています。Gibson Assemblyは、工業的に関連性のある分子クローニング技術として登場し、学生に適用可能な経験を提供しようとしています。分子クローニングは、従来の学部の教室では概念化が難しい技術です。
私たちは、学生が自分の実験を設計および評価し、本物の研究プロジェクトに貢献する実践的な実験モジュールを設計しました。これにより、クローニングプロセスと研究の応用についての理解が深まります。分子クローニング技術を利用した他のコースベースの学部研究体験が発表されていますが、適応可能なギブソンアセンブリモジュールを含むものはありません。
このコースベースの学部研究体験の学習成果を測定するために、すべての資料を設計しました。これが、大学レベルの分子生物学研究室での教員評価と学生教育を改善するための、簡単に実装できる科学教育ツールとして役立つことを願っています。まず、ゲノムDNA、プラスミド、合成DNAなど、遺伝子インサートのDNAテンプレートソースを決定します。
遺伝子インサートとベクターのDNA配列を取得します。目的のインサート配列とベクター配列を新しいDNA配列ファイルとしてBenchlingにインポートします。次に、Gibsonアセンブリ反応で使用する各インポートされたシーケンスを開きます。
次に、画面の下部にあるアセンブリウィザードツールを見つけます。「アセンブリ・ウィザード」をクリックし、「新規アセンブリの作成」を選択します。表示されたオプションから「Gibson (ギブソン)」を選択し、「開始」(Start) をクリックしてアセンブリを開始します。
Vector Sequenceウィンドウで、遺伝子インサートの3つのプライムエンドから目的のエンドポイントまでのベクターバックボーンベースを選択します。選択したら、画面下部の「Backbone」タブをクリックし、「Set Fragment」を選択します。「挿入シーケンス」(Insert Sequence) ウィンドウで、アセンブリに含めるすべての挿入ベースを選択します。
選択したら、画面下部の「挿入」タブをクリックし、「フラグメントを設定」を選択します。複数の遺伝子インサートがある場合は、Assembly Wizardの右側にあるプラスボタンをクリックします。「挿入シーケンス」(Insert Sequence) ウィンドウで、アセンブリに含める追加のインサートのすべてのベースを選択します。
選択したら、画面下部の「挿入」タブをクリックし、「フラグメントを設定」を選択します。すべてのフラグメントを設定したら、アセンブリの名前を目的のプラスミド名に変更します。アセンブリウィザードの右側にある「アセンブリ」をクリックします。
次に、シーケンスフォルダーとプライマーフォルダーの両方に目的のフォルダーの場所を選択し、[作成]をクリックして組換えプラスミド配列をアセンブルします。次に、アセンブルされたプラスミドを開き、[Assembly History]をクリックして、基本的なプラスミドマップと、その派生元となった配列の概要を表示します。Assembly Parametersタブで、アセンブリ用に設計されたプライマーの名前を表示します。
各インサートに2つのプライマーがあり、プライマー名がDNA配列ファイルのタイトルから導かれていることを確認してください。プライマーの融解温度と推奨アニーリング温度が一致していることを確認してください。目的のプラスミドのプライマーデザインが完了したら、Assembly WizardでFinalizeをクリックします。
DNAテンプレートを用いたグラジエントPCR実験を用いて、インサートプライマーとベクター特異的プライマーペアの両方を試験し、最適なアニーリング温度を確保します。アニーリング温度が決定したら、プライマー溶液、DNAテンプレート、および学生用のPCR反応に必要な試薬のアリコートを作成します。まず、インストラクターからPCR用のプライマーとテンプレートDNA溶液を入手します。
ここに示す試薬を使用して、25マイクロリットルのPCR反応を調製し、目的のDNA配列の線状フラグメントを取得します。サーモサイクラーで反応を循環させます。アニーリング温度がプライマーに適切であり、伸長時間が目的のアンプリコンの長さに適していることを確認してください。
次に、各反応の5マイクロリットルをアガロースゲル電気泳動で分析します。ゲルが泳いでいる間に、プラスミドDNAをテンプレートとして使用した各反応に1マイクロリットルのDpnI制限酵素を加えます。この混合物を摂氏37度で1時間インキュベートします。
次に、ゲルを画像化して、PCRが成功し、正しい増幅が達成されたことを確認します。市販のPCR精製キットを使用して、成功したPCR反応を精製します。マイクロボリューム分光光度計を使用して精製されたPCR産物の濃度を測定し、その後のギブソンアセンブリ計算に使用します。
ギブソンアセンブリ反応コンポーネントをピペットで固定します。反応を摂氏50度で15分間インキュベートします。反応がインキュベートしている間に、化学的にコンピテントな大腸菌細胞を氷上で解凍して形質転換します。
2マイクロリットルのギブソンアセンブリ反応を、熱ショックにより化学的にコンピテントな細胞に変換します。形質転換細胞の100マイクロリットルを2つの選択プレートにピペットで移し、滅菌したビーズで広げます。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。
翌日は、プレートを摂氏4度で保管します。次に、すべてのプレート上のコロニーをカウントし、指定された式を使用して形質転換効率を計算します。マーカーを使用して、選択プレート上の4つの異なるコロニーを選択し、学生のイニシャルと番号でラベルを付けます。
抗生物質を含む新しいLB寒天プレートを選択して、象限に分割します。各コロニーの約半分を使用して、それぞれの象限に再配置します。選択のために、コロニーの同一性でラベル付けされたチューブに正しい抗生物質濃度を追加します。
次に、5ミリリットルの液体LB培養物に、選択した4つのコロニーのそれぞれの残りの半分を接種します。液体培養物を摂氏37度の振とうインキュベーターで一晩インキュベートし、寒天プレートを同じ温度の静的インキュベーターでインキュベートします。ミニプレップキットを使用して、液体培養物からプラスミドDNAを単離します。
単離されたプラスミドDNAの濃度をナノグラム/マイクロリットルで測定します。単離されたプラスミドを解析するための制限酵素消化性PCRスクリーニングを設計した後、制限酵素消化反応またはPCR反応をピペットで洗浄します。次に、ゲル電気泳動で結果を分析します。
ギブソンアセンブリモジュールが完了したら、学生参加者にラボミーティングで多肢選択式のポストアンケートに回答してもらいます。アンケートの前後の回答から得られたすべてのデータを組み合わせて分析し、その統計的有意性を評価します。プロジェクト後、平均コンテンツスコアは63.7%から80.4%へと大幅に上昇し、分子生物学とクローニングの概念に対する学生の理解が深まったことを示しています。
平均学期の信頼度は3.52から3.87に大幅に増加し、効果サイズが大きいほど、分子生物学の用語に対する学生の理解が深まったことが示されています。平均的な学生の実験技術に対する自信は3.82から4.33に大幅に増加し、分子生物学技術に対する快適性が向上したことを示しています。ギブソンアセンブリという用語に精通していることを示す回答の数は、アンケート前からアンケート後にかけて大幅に増加し、この用語を説明できる人が顕著に増加しました。
ギブソンアセンブリ技術の実行に対する自信は、セッション前は中立または反対から、セッション後は同意または強く同意するようになり、ほとんどの回答で改善されました。一般的な生物学のトピックに対する学生の自信は、統計的に有意な変化を示さなかった。対照的に、ギブソンの組み立てに関する専門的な質問に対する信頼度は大幅に向上しました。
