Meu grupo de pesquisa se concentra na biologia molecular fundamental e na bioquímica de linhas de montagem biossintéticas em bactérias. Nosso objetivo é projetar bactérias para produzir novos antibióticos. Somos apaixonados por trazer esse trabalho para a sala de aula, proporcionando aos alunos experiência prática em técnicas de ponta em biotecnologia.
A clonagem baseada em topoisomerase é atualmente usada na sala de aula de biologia molecular de graduação da Cal Poly para apresentar aos alunos a clonagem molecular. A Gibson Assembly surgiu como uma técnica de clonagem molecular industrialmente relevante e estamos tentando fornecer aos alunos experiências aplicáveis. A clonagem molecular é uma técnica que pode ser difícil de conceituar em uma sala de aula tradicional de graduação.
Projetamos um módulo de laboratório prático no qual os alunos projetam e avaliam seus experimentos, além de contribuir para projetos de pesquisa autênticos. Isso aumenta sua compreensão do processo de clonagem e das aplicações de seu trabalho. Embora outras experiências de pesquisa de graduação baseadas em cursos utilizando técnicas de clonagem molecular tenham sido publicadas, nenhuma inclui um módulo de montagem Gibson adaptável.
Projetamos todos os materiais para medir os resultados de aprendizagem para esta experiência de pesquisa de graduação baseada em curso. Esperamos que isso sirva como uma ferramenta de educação científica facilmente implementável para melhorar a avaliação do instrutor e a educação dos alunos em laboratórios de biologia molecular de nível universitário. Para começar, determine a fonte do modelo de DNA para as inserções de genes, como DNA genômico, plasmídeo ou DNA sintético.
Recupere as sequências de DNA das inserções de genes e do vetor. Importe as sequências de inserção e sequências vetoriais desejadas para o Benchling como novos arquivos de sequência de DNA. Em seguida, abra cada sequência importada a ser usada na reação de montagem de Gibson.
Agora localize a ferramenta Assistente de montagem na parte inferior da tela. Clique em Assistente de montagem e selecione Criar nova montagem. Nas opções fornecidas, selecione Gibson e clique em Iniciar para iniciar a montagem.
Na janela Sequência vetorial, selecione as bases da espinha dorsal do vetor a partir das 3 extremidades principais da inserção do gene até o ponto final desejado. Uma vez selecionado, clique na guia Backbone na parte inferior da tela e escolha Definir fragmento. Na janela Sequência de inserção, selecione todas as bases de inserção a serem incluídas na montagem.
Uma vez selecionado, clique na guia Inserir na parte inferior da tela e escolha Definir fragmento. Se houver várias inserções de genes, clique no botão de adição no lado direito do Assistente de montagem. Na janela Sequência de inserção, selecione todas as bases para a inserção adicional a ser incluída na montagem.
Uma vez selecionado, clique na guia Inserir na parte inferior da tela e escolha Definir fragmento. Depois que todos os fragmentos estiverem definidos, renomeie o assembly para o nome de plasmídeo desejado. Clique em Montar no lado direito do Assistente de montagem.
Em seguida, selecione o local da pasta desejada para a pasta de sequência e a pasta do primer e clique em Criar para montar a sequência de plasmídeo recombinante. Agora abra o plasmídeo montado e clique em Assembly History para visualizar um mapa básico de plasmídeo e uma visão geral das sequências das quais ele foi derivado. Na guia Parâmetros de montagem, visualize os nomes dos primers projetados para a montagem.
Confirme se há dois primers para cada bula e se os nomes dos primers são derivados dos títulos dos arquivos de sequência de DNA. Certifique-se de que as temperaturas de fusão do primer e as temperaturas de recozimento sugeridas sejam compatíveis. Quando o design do primer para os plasmídeos desejados estiver concluído, clique em Finalizar no Assistente de montagem.
Usando um experimento de PCR de gradiente com os modelos de DNA, teste os pares de primers específicos do inserto e do vetor para temperaturas ideais de recozimento. Uma vez que as temperaturas de recozimento tenham sido determinadas, crie alíquotas de soluções de primer, modelos de DNA e reagentes necessários para reações de PCR para os alunos. Para começar, obtenha primers e soluções de DNA modelo para PCR com o instrutor.
Usando os reagentes mostrados aqui, prepare reações de PCR de 25 microlitros para obter fragmentos lineares das sequências de DNA desejadas. Cicle a reação em um termociclador. Certifique-se de que a temperatura de recozimento seja apropriada para os primers e que o tempo de extensão seja adequado para o comprimento do amplicon desejado.
Em seguida, analise cinco microlitros de cada reação por meio de eletroforese em gel de agarose. Enquanto o gel estiver funcionando, adicione um microlitro de enzima de restrição DpnI a cada reação que usou DNA de plasmídeo como modelo. Incube esta mistura por uma hora a 37 graus Celsius.
Em seguida, faça uma imagem do gel para confirmar que a PCR foi bem-sucedida e a amplificação correta foi alcançada. Purifique todas as reações de PCR bem-sucedidas usando um kit de purificação de PCR disponível comercialmente. Meça a concentração do produto de PCR purificado usando um espectrofotômetro de microvolume para uso em cálculos de montagem Gibson subsequentes.
Pipete os componentes da reação de montagem Gibson. Incube a reação a 50 graus Celsius por 15 minutos. Enquanto as reações incubam, descongele as células de Escherichia coli quimicamente competentes no gelo para transformação.
Transforme dois microlitros da reação de montagem de Gibson em células quimicamente competentes por meio de choque térmico. Pipete 100 microlitros das células transformadas em duas placas de seleção e espalhe com esferas esterilizadas. Incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, guarde o prato a quatro graus Celsius. Em seguida, conte as colônias em todas as placas e calcule a eficiência da transformação usando a fórmula fornecida. Usando um marcador, selecione e rotule quatro colônias distintas na placa de seleção com as iniciais do aluno e um número.
Pegue uma nova placa de ágar LB contendo antibióticos para seleção e divida-a em quadrantes. Use aproximadamente metade de cada colônia para voltar ao respectivo quadrante. Adicione a concentração correta de antibiótico aos tubos rotulados com a identidade da colônia para seleção.
Em seguida, inocular uma cultura líquida de cinco mililitros de LB com a outra metade de cada uma das quatro colônias selecionadas. Incubar as culturas líquidas em uma incubadora agitada a 37 graus Celsius durante a noite e a placa de ágar em uma incubadora estática na mesma temperatura. Isole o DNA do plasmídeo das culturas líquidas usando um mini kit de preparação.
Meça a concentração do DNA do plasmídeo isolado em nanogramas por microlitro. Depois de projetar uma tela de PCR de digestão de restrição para analisar os plasmídeos isolados, pipete as reações de digestão de restrição ou reações de PCR. Em seguida, analise os resultados por eletroforese em gel.
Assim que o módulo de montagem da Gibson for concluído, peça aos alunos participantes que preencham o questionário de múltipla escolha na reunião de laboratório. Combine todos os dados das respostas pré e pós-questionário para análise e avalie sua significância estatística. Após o projeto, a pontuação média do conteúdo aumentou significativamente de 63,7% para 80,4%, indicando uma melhor compreensão dos alunos sobre biologia molecular e conceitos de clonagem.
A confiança média do prazo aumentou significativamente de 3,52 para 3,87, com um grande tamanho de efeito demonstrando uma melhor compreensão dos termos de biologia molecular pelos alunos. A confiança média do aluno na execução de técnicas de laboratório aumentou significativamente de 3,82 para 4,33, mostrando maior conforto com técnicas de biologia molecular. O número de respostas indicando familiaridade com o termo montagem de Gibson aumentou significativamente do pré para o pós-questionário, com um aumento notável naqueles que poderiam explicar o termo.
A confiança na execução da técnica de montagem de Gibson melhorou com a maioria das respostas, mudando de neutra ou discordante antes da sessão para concordar ou concordar totalmente depois. A confiança dos alunos em tópicos gerais de biologia não mostrou mudanças estatisticamente significativas. Em contraste, a confiança nas questões especializadas de montagem da Gibson aumentou significativamente.
