我的研究小组专注于细菌生物合成流水线的基础分子生物学和生物化学。我们的目标是改造细菌来制造新的抗生素。我们热衷于将这项工作带入课堂，为学生提供生物技术前沿技术的实践经验。
基于拓扑异构酶的克隆目前在加州理工学院本科生分子生物学课堂上使用，向学生介绍分子克隆。Gibson Assembly 已成为一种与工业相关的分子克隆技术，我们正在努力为学生提供适用的经验。分子克隆是一种在传统的本科课堂中难以概念化的技术。
我们设计了一个动手实验模块，学生可以在其中设计和评估他们的实验，并为真实的研究项目做出贡献。这增强了他们对克隆过程及其工作应用的理解。虽然已经发表了其他基于课程的利用分子克隆技术的本科生研究经验，但没有一个包括适应性强的 Gibson 组装模块。
我们设计了所有材料来衡量这种基于课程的本科研究体验的学习成果。我们希望这将成为一种易于实施的科学教育工具，以改善大学分子生物学实验室的教师评估和学生教育。首先，确定基因插入片段的 DNA 模板来源，例如基因组 DNA、质粒或合成 DNA。
检索基因插入片段和载体的 DNA 序列。将所需的插入序列和载体序列作为新的 DNA 序列文件导入 Benchling。然后打开每个导入的序列，用于 Gibson 组装反应。
现在，在屏幕底部找到 Assembly Wizard 工具。单击 Assembly Wizard，然后选择 Create New Assembly。从提供的选项中，选择 Gibson，然后单击 Start 开始装配。
在 Vector Sequence 窗口中，选择从基因插入片段的 3 个主要端开始到所需终点的载体骨架碱基。选择后，单击屏幕底部的 Backbone 选项卡，然后选择 Set Fragment。在 Insert Sequence 窗口中，选择要包含在装配体中的所有插入基体。
选择后，单击屏幕底部的 Insert 选项卡，然后选择 Set Fragment。如果有多个基因插入片段，请单击 Assembly Wizard 右侧的加号按钮。在 Insert Sequence 窗口中，选择要包含在装配体中的附加插入的所有基。
选择后，单击屏幕底部的 Insert 选项卡，然后选择 Set Fragment。设置完所有片段后，将组装体重命名为所需的质粒名称。单击 Assembly Wizard 右侧的 Assemble。
然后为序列文件夹和引物文件夹选择所需的文件夹位置，然后单击 Create（创建）以组装重组质粒序列。现在打开组装的质粒并单击 Assembly History 查看基本质粒图谱和其来源序列的概述。在 Assembly Parameters 选项卡中，查看为程序集设计的引物的名称。
确认每个插入片段有两个引物，并且引物名称源自 DNA 序列文件标题。确保引物熔解温度和建议的退火温度兼容。所需质粒的引物设计完成后，单击 Assembly Wizard 中的 Finalize。
使用 DNA 模板的梯度 PCR 实验，测试插入片段和载体特异性引物对的最佳退火温度。确定退火温度后，为学生制备引物溶液、DNA 模板和 PCR 反应所需试剂的等分试样。首先，从讲师处获得用于 PCR 的引物和模板 DNA 溶液。
使用此处显示的试剂，制备 25 μL PCR 反应物，以获得所需 DNA 序列的线性片段。在热循环仪中循环反应。确保退火温度适合引物，并且延伸时间适合所需扩增子的长度。
接下来，通过琼脂糖凝胶电泳分析每个反应的 5 μL。当凝胶电泳时，向使用质粒 DNA 作为模板的每个反应中加入 1 μL DpnI 限制性内切酶。将此混合物在 37 摄氏度下孵育 1 小时。
然后对凝胶进行成像，确认 PCR 成功并实现正确的扩增。使用市售的 PCR 纯化试剂盒纯化任何成功的 PCR 反应。使用微量分光光度计测量纯化的 PCR 产物的浓度，用于后续的 Gibson 组装计算。
移液 Gibson 组装反应组分。在 50 摄氏度下孵育反应 15 分钟。在反应孵育时，在冰上解冻化学感受态的大肠杆菌细胞以进行转化。
通过热休克将两微升 Gibson 组装反应转化为化学感受态细胞。将 100 微升转化的细胞移液到两个选择板上，并用消毒的珠子铺展。将板在 37 摄氏度下孵育过夜。
第二天，将板存放在 4 摄氏度。然后计数所有平板上的菌落，并使用给定的公式计算转化效率。使用记号笔，在选择板上选择并标记四个不同的菌落，并标上学生的姓名首字母和数字。
取含有抗生素的新 LB 琼脂平板进行选择，并将其分成象限。使用每个菌落的大约一半来重新定位到相应的象限。将正确的抗生素浓度添加到标有菌落身份的试管中以进行选择。
然后用四个选定菌落中每个菌落的另一半接种 5 mL 液体 LB 培养物。将液体培养物在 37 摄氏度的振荡培养箱中孵育过夜，并将琼脂板在相同温度下的静态培养箱中孵育。使用小型制备试剂盒从液体培养物中分离质粒 DNA。
测量分离的质粒 DNA 的浓度，单位为纳克/微升。在设计限制性内切 PCR 筛选以分析分离的质粒后，移液管限制性内切反应或 PCR 反应。然后通过凝胶电泳分析结果。
完成 Gibson 组装模块后，要求学生参与者在实验会议中完成多项选择题后问卷。合并问卷前后回答中的所有数据进行分析，并评估其统计显著性。项目结束后，平均内容得分从 63.7% 显着提高到 80.4%，表明学生对分子生物学和克隆概念的理解有所提高。
平均术语置信度从 3.52 显着增加到 3.87，较大的效应量表明学生对分子生物学术语的理解有所提高。平均学生对执行实验室技术的信心从 3.82 显着增加到 4.33，表明对分子生物学技术的舒适度增强。从问卷调查前到问卷调查后，表示熟悉 Gibson assembly 一词的回答数量显着增加，能够解释该术语的人数显着增加。
大多数回答对执行 Gibson 组装技术的信心都有所提高，从会议前的中立或不同意转变为会议后的同意或强烈同意。学生对一般生物学主题的信心没有统计学上的显著变化。相比之下，对专业 Gibson 装配问题的信心显着增加。
