Моя исследовательская группа специализируется на фундаментальной молекулярной биологии и биохимии биосинтетических сборочных линий у бактерий. Наша цель состоит в том, чтобы спроектировать бактерии для создания новых антибиотиков. Мы с энтузиазмом переносим эту работу в класс, предоставляя студентам практический опыт работы с передовыми методами биотехнологии.
Клонирование на основе топоизомеразы в настоящее время используется в классе молекулярной биологии для студентов Калифорнийского политехнического университета, чтобы познакомить студентов с молекулярным клонированием. Gibson Assembly стал промышленно релевантным методом молекулярного клонирования, и мы пытаемся предоставить студентам применимый опыт. Молекулярное клонирование — это метод, который может быть трудно концептуализировать в традиционной аудитории бакалавриата.
Мы разработали практический лабораторный модуль, в котором студенты планируют и оценивают свой эксперимент, а также вносят свой вклад в аутентичные исследовательские проекты. Это улучшает их понимание процесса клонирования и применения их работы. Несмотря на то, что были опубликованы другие исследовательские работы студентов на основе курсов с использованием методов молекулярного клонирования, ни один из них не включает адаптируемый модуль сборки Gibson.
Мы разработали все материалы для измерения результатов обучения для этого исследовательского опыта на основе курса бакалавриата. Мы надеемся, что это послужит легко реализуемым инструментом научного образования для улучшения оценки преподавателей и обучения студентов в лабораториях молекулярной биологии на уровне колледжа. Для начала определите источник матрицы ДНК для вставок генов, такой как геномная ДНК, плазмида или синтетическая ДНК.
Извлечение последовательностей ДНК генных вставок и вектора. Импортируйте нужные вставные последовательности и векторные последовательности в Benchling в виде новых файлов последовательностей ДНК. Затем откройте каждую импортированную последовательность, которая будет использоваться в реакции сборки Гибсона.
Теперь найдите инструмент «Мастер сборки» в нижней части экрана. Нажмите «Мастер сборок», затем выберите «Создать новую сборку». Из предложенных вариантов выберите Gibson и нажмите кнопку Пуск, чтобы начать сборку.
В окне «Векторная последовательность» выберите основания векторной магистрали, начиная с 3 простых концов генной вставки до нужной конечной точки. После выбора перейдите на вкладку «Магистраль» в нижней части экрана и выберите «Задать фрагмент». В окне "Последовательность вставок" выберите все основания вставки, которые должны быть включены в сборку.
После выбора перейдите на вкладку «Вставка» в нижней части экрана и выберите «Установить фрагмент». Если вставок генов несколько, нажмите кнопку с плюсом в правой части мастера сборки. В окне "Последовательность вставок" выберите все основания для дополнительной вставки, которая будет включена в сборку.
После выбора перейдите на вкладку «Вставка» в нижней части экрана и выберите «Установить фрагмент». После установки всех фрагментов переименуйте сборку в нужное имя плазмиды. Нажмите кнопку Собрать в правой части мастера сборки.
Затем выберите желаемое расположение папки для папки последовательности и папки праймера и нажмите кнопку Создать, чтобы собрать рекомбинантную последовательность плазмид. Теперь откройте собранный плазмид и нажмите «История сборки», чтобы просмотреть базовую карту плазмиды и обзор последовательностей, из которых она была получена. На вкладке "Параметры сборки" просмотрите названия грунтовок, предназначенных для сборки.
Убедитесь, что для каждой вставки существует два праймера и что названия праймеров получены из названий файлов последовательностей ДНК. Убедитесь, что температура плавления грунтовки и рекомендуемая температура отжига совместимы. После того, как разработка грунтовки для желаемых плазмид будет завершена, нажмите кнопку "Завершить" в мастере сборки.
Используя эксперимент с градиентной ПЦР с матрицами ДНК, протестируйте как вставные, так и векторно-специфичные пары праймеров для достижения оптимальных температур отжига. После определения температур отжига создать аликвоты растворов праймеров, матрицы ДНК и необходимые реагенты для ПЦР-реакций для студентов. Для начала получите праймеры и шаблонные растворы ДНК для ПЦР у инструктора.
Используя показанные здесь реагенты, приготовьте 25-микролитровые ПЦР-реакции для получения линейных фрагментов желаемых последовательностей ДНК. Цикл реакции в термоамплификаторе. Убедитесь, что температура отжига подходит для грунтовок и что время продления соответствует длине желаемой ампликона.
Затем проанализируйте пять микролитров каждой реакции с помощью электрофореза в агарозном геле. Пока гель работает, добавьте по одному микролитру фермента рестрикции DpnI в каждую реакцию, в которой в качестве матрицы использовалась плазмидная ДНК. Выдерживайте эту смесь в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия.
Затем визуализируйте гель, чтобы подтвердить, что ПЦР прошла успешно и была достигнута правильная амплификация. Очистите любые успешные реакции ПЦР с помощью имеющегося в продаже набора для очистки ПЦР. Измерьте концентрацию очищенного продукта ПЦР с помощью микрообъемного спектрофотометра для использования в последующих сборочных расчетах Gibson.
Пипетка Gibson сборка реакционных компонентов. Инкубируйте реакцию при температуре 50 градусов Цельсия в течение 15 минут. Пока реакции инкубируются, размораживают химически компетентные клетки Escherichia coli на льду для трансформации.
Преобразуйте два микролитра сборочной реакции Гибсона в химически компетентные клетки с помощью теплового шока. Пипеткой нанесите 100 микролитров преобразованных клеток на две селекционные пластины и распределите стерилизованными шариками. Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.
На следующий день храните тарелку при температуре четыре градуса Цельсия. Затем посчитаем колонии на всех пластинах и рассчитаем эффективность преобразования по заданной формуле. С помощью маркера выделите и обозначьте четыре отдельные колонии на листе выбора инициалами и номером учащегося.
Возьмите для выбора новую агаровую пластину LB, содержащую антибиотики, и разделите ее на квадранты. Используйте примерно половину каждой колонии, чтобы вернуться к соответствующему квадранту. Добавьте правильную концентрацию антибиотика в пробирки, помеченные идентификацией колонии, для выбора.
Затем инокулируйте пятимиллилитровую жидкую культуру LB с другой половиной каждой из четырех выбранных колоний. Инкубируйте жидкие культуры в встряхивающем инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи и в агаровой тарелке в статическом инкубаторе при той же температуре. Выделите плазмидную ДНК из жидких культур с помощью мини-набора для подготовки.
Измерьте концентрацию выделенной плазмидной ДНК в нанограммах на микролитр. После разработки ПЦР-скрининга рестрикционного расщепления для анализа выделенных плазмид, пипетки реакций рестрикционного расщепления или ПЦР-реакций. Затем анализируют результаты с помощью гель-электрофореза.
После завершения модуля сборки Gibson попросите студентов-участников заполнить анкету с несколькими вариантами ответов на лабораторном собрании. Объедините все данные из ответов до и после анкеты для анализа и оцените их статистическую значимость. После завершения проекта средний балл содержания значительно увеличился с 63,7% до 80,4%, что указывает на улучшение понимания студентами концепций молекулярной биологии и клонирования.
Средняя достоверность термина значительно увеличилась с 3,52 до 3,87, при этом большая величина эффекта продемонстрировала улучшение понимания студентами терминов молекулярной биологии. Уверенность среднестатистического студента в выполнении лабораторных техник значительно увеличилась с 3,82 до 4,33, что свидетельствует о повышенном комфорте при использовании методов молекулярной биологии. Количество ответов, указывающих на знакомство с термином «сборка Гибсона», значительно увеличилось от анкеты до и после опроса, при этом заметно возросло число тех, кто смог объяснить этот термин.
Уверенность в выполнении техники сборки Гибсона повышалась с большинством ответов, смещаясь от нейтрального или несогласия до сеанса к согласию или полному согласию после. Уверенность студентов в темах по общей биологии не показала статистически значимых изменений. Напротив, доверие к специализированным вопросам сборки Gibson значительно возросло.
