标签胚胎小鼠血管的方法

摘要

本文介绍了标签胚胎皮肤和胸腺血管的方法。

摘要

功能的血管网络的建立是一个器官形成的重要组成部分，是最佳的器官功能要求。例如，在胸腺适当的血管形成和图案是胸腺细胞进入到器官和成熟的T细胞向周边出口所必需的。在胸腺血管的空间安排，是依赖于从局部微环境的信号，即胸腺上皮细胞（TEC）。最近的一些报告表明，这些信号结果在胸腺血管缺陷^1,2中断。以前的研究已经描述技术用于标签的新生儿和成人的胸腺^血管 1,2 。我们在这里展示一个标签血管在胚胎胸腺技术。这种方法结合使用FITC -葡聚糖或加纳（Bandeiraea）Simplicifolia凝集素我（1 - GSL isolectin乙_4）面部静脉注射和CD31抗体染色，以确定胸腺的血管结构和PDGFR -β标签胸腺血管周围间^质 3-5 。还提供了使用冰冻切片或vibratome部分选项。该协议可用于识别胸腺血管的缺陷，这是定义在胸腺血管形成的TEC -派生分子的角色的关键。作为方法的标签，整个血管，它也可以被用来分析多个器官和整个组织，包括皮肤和^心脏 6-10胚胎的血管网络。

研究方案

1。荧光标记的葡聚糖和金思朗我isolectin乙面部静脉注射标签胚胎血管

1. 准备FITC -葡聚糖（50ug/mL）在磷酸盐缓冲液（PBS）或金思朗1 - isolectin乙_{4（20ug/200uL）}在1.5ml的Eppendorf管中，并在PBS温暖至37 ° C 。股票1.25MM快速绿/ PBS 100uL FITC -葡聚糖溶液（总体积毫升）和股票1.25MM快速180uL绿/ PBS金思朗1 - isolectin乙_4（总体积200uL），这样的解决方案是明显的蓝色。
2. 解剖E14.5 - E18.5胚胎和卵黄囊在一起，留下的尿囊柄（脐动脉和静脉）不变。
3. 胚胎转移到一个新的皮特里盘（60 × 15毫米），他们沉浸在PBS在室温下。
4. 胚胎的位置，以提供的头部/面部矢状。使用微解剖钳轻轻抓住头胚胎。
5. 使用30G针头，注入50uL FITC -葡聚糖（50ug/mL）或金思朗1 -到面部静脉针指 ​​向的后脑勺isolectin乙_4（20ug 200uL PBS）。
6. 当染料是在脐静脉可见，去掉针头和独立的胚胎从尿囊柄（脐动脉和静脉）。
7. 注射之后，让胚胎在室温下PBS为2-3分钟，使染料整个胚胎循环。

2。全安装皮肤血管分析

1. 使染料流通整个胚胎后，取下皮肤样本地区的四肢，背部，和胃，等^8,9。
2. 在冷PBS洗皮肤样本，并在4％PFA / PBS固定为2小时^8,9。 10分钟，每个4ML明确小瓶用2ml冷PBS洗3次。
3. 放在皮肤样本在显微镜幻灯片，并添加100μL安装媒体每张幻灯片和一个玻璃盖。
4. 允许的幻灯片，以干在黑暗的存储区域。
5. 继续执行步骤2的图像采集“部分。

3。胸腺及心脏血管，血管周围细胞和冰冻切片的多色标签（继续从第1款，第7步）

1. “闪光冻结”整个胚胎在液氮中。胚胎可以储存于-80 ° C，直到分析。
2. 另外，解剖出胸腺，在4 °彗星PBS冲洗，并在2小时修复液2ml 4％多聚甲醛（PFA）/ PBS。洗3次，地点在华侨城thymi冷PBS，并冻结和存储10分钟，直到使用在-80 ° C
3. cryosectioning，传播“块”一节OCT和安装的胚胎或切片解剖器官/组织。
4. 切成10微米厚的冰冻组织和收集的幻灯片。
5. 修复部分在5-10分钟丙酮。在寒冷的TBS清洗3次。
6. 在室温湿度试验箱在10％驴血清/ TBS座。
7. 孵育1初级抗体100μL湿度试验箱在4小时通宵部分℃：在这个例子中，我们使用大鼠抗小鼠CD31（1:100）标签内皮细胞和山羊抗鼠PDGFR -β （1:100）标签血管周围细胞。它是有用的覆盖与单独切割的封口膜条幻灯片，以确保该抗体是统一部分蔓延。
8. 初级抗体的潜伏期后，在寒冷的TBS洗节3倍。 100μL适当的二级抗体孵育至少30分钟。
9. 在寒冷的TBS清洗3次。加入100μL安装媒体每张幻灯片和一个玻璃盖。
10. 允许的幻灯片，以干在黑暗的存储区域。
11. 继续执行“图像采集”部分。

4。 vibratome部分胸腺血管和血管周围细胞的多色标签（继续从第1款，第7步）

1. 解剖出胚胎胸腺叶，冷PBS冲洗。
2. 4％PFA / PBS在室温下2小时修复胸腺。
3. 在PBS - TRITON X（0.15％）的3倍，10分钟和地方thymi洗净，在一个小塑料盒和淹没在4％的低熔融琼脂糖/ PBS（4℃）。胸腺应与墨盒底部的接触。
4. 允许琼脂糖上冰（3-5分钟），以巩固。使用刀片，切断多余的琼脂糖。添加胶水vibratome块，并坚持以块样品。
5. 直到样品和刀片都沉浸冷PBS vibratome水浴。
6. 设置速度和幅度（高幅度和低适中的速度，是理想的软胸腺部分）。如果部分打破由于多余的搅拌，应减少的幅度。
7. 切割50微米的部分。
8. 使用画笔，在冷PBS 24孔微孔板收集部分。
9. 块切片在500μL10％驴血清PBS - TRITON X为30分钟（0.15％）。
10. 孵育部分为8小时初级抗体过夜，如抗CD31和抗- PDGFR -β在有盖的24孔微孔板。
11. 洗净比PBS - TRITON X 3次（0.15％）共8个小时，在4 ° C。
12. 块切片在10％驴血清PBS - TRITON X为30分钟（0.15％）。
13. 孵育4℃，适当的二次抗体的部分为8小时至过夜。
14. 洗净比PBS - TRITON X 3次（0.15％）共8个小时，在4 ° C。
15. 重新修复的样品在4％PFA / PBS在冰上30分钟。
16. 在冰上超过30分钟，洗净PBS - TRITON X 3次（0.15％）。
17. 通过分级甲醇/ PBS -海神X系列脱水样本：25％甲醇，50％甲醇，75％甲醇，每一步都在10分钟和100％甲醇。 10分钟后，替换100％，与新鲜甲醇的甲醇和1小时在室温下孵育。
18. 在一个玻璃容器中，在1:2的比例混合BABB（苯甲醇苯甲酸苄酯）。为终浓度为50％和50％的BABB甲醇与甲醇结合BABB。孵育BABB样品：甲醇为10-15分钟。
19. 转移样品到玻璃容器100％BABB孵育10-15分钟或直到被清除，在室温下。
20. 填充新鲜的100％的BABB和转让样品侧面抑郁幻灯片（0.7毫米深度）。 2-3指甲油大衣盖玻璃（1.5号）和密封。允许波兰在室温下硬化钉在黑暗中，然后将其存储样品在4 ° C。
    注：幻灯片等，必须完全密封的共聚焦图像采集前。图像应在12-24小时之内，收购在BABB荧光染料褪色。
21. 继续执行“图像采集”部分。

5。图像采集

1. 图片10微米的冰冻切片，共聚焦显微镜使用488计划复消色差透镜20X/0.8目标（512 x 512像素） - （FITC-dextran/GSL 1 - isolectin乙_4），543 - ，和633纳米的激光线。
2. 收购焦Z -整装皮肤和50微米琼脂糖包埋切片使用488计划复消色差透镜10X/0.4目标（512 x 512像素）的部分- （FITC-dextran/GSL 1 - isolectin _乙 4），543 - 633纳米的激光线。串行Z型截面应收集在1微米顺序，每个相应的通道。
3. 重建串行Z轴部分使用蔡司Axiovision 4.6或其他图像分析软件。

6。代表性的成果：

胚胎血管的有效标签是评估在胚胎小鼠的血管缺陷的关键。图1显示了特定的标签E16.5胸腺血管（1A - B）和CD31（1B）的共同标签，除了左，右心室的染色（1E - F），分别。金思朗我isolectin乙₄协议是在第1，第3和5中描述的冰冻切片在这些实验中使用。图1C - D E16.5小鼠皮肤的血液血管网全安装的标签，使用在第1，第2条所述的协议，和5所示。

图1传奇。 FITC金思朗我- isolectin乙₄到E16.5小鼠胚胎的面部静脉注射 。 E.胚胎心脏E. F. Cryosection（右A. Cryosection胚胎胸腺注射后CD31的共同标签。B.合并isolectin B级_4。C.和D.全胚胎皮肤血管注射后安装。心室）F.（左心室）注射后。

讨论

全安装和PECAM - 1（CD31）染色部分标签在胚胎小鼠的血管的常规方法。这些方法需要使用的直接和/或间接免疫荧光和洗涤剂通透小鼠组织。这被证明是一个相当及时处理。在这里，我们有FITC -葡聚糖或isolectin B级₄面部静脉注射直接标记的胚胎血管，从而消除了抗体标记的步骤要求。此外，这种方法使血管功能状态的评估，将通过这种方法，而不是由传统抗体染色方法显示“漏水”的表型。...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号
FITC -葡聚糖	西格玛	FD150S - 1G
荧光标记金思朗1 - 4 isolectin乙	媒介实验室	FL - 1201
快绿	MP生物医学	195178
煤灰	Fluka公司	76240
胎牛血清	亚特兰大生物	S11550
最佳切削温度化合物（华侨城	VWR	25608-930
丙酮	JT贝克	9006-33
驴血清	杰克逊	017-000-121
大鼠抗小鼠CD31，	BD Pharmingen公司	558736
羊抗鼠PDGFR -β	R＆D系统	AF1042
驴抗大鼠CD31的Alexa的647（Invitrogen公司）	Biolegend	102516
驴抗山羊Alexa的594（Invitrogen公司）	Invitrogen公司	A11058
TRITON X -100	Sigma - Aldrich公司	X - 100
低熔点琼脂糖/ PBS	Sigma - Aldrich公司	A9414 - 25G
甲醇	Fisher Scientific则	A413 - 4
苯甲醇	阿库罗斯福冈科学	148390010
苯甲酸苄酯	阿库罗斯福冈科学	105860010
抑郁症的幻灯片	Fisher Scientific则	S175201
Fluorogel	电子显微镜科学	17985-10
玻璃盖（22X22）-1.5	Thermo Scientific的	152222
蔡司LSM 510 META共聚焦显微镜	蔡司
微解剖钳	Roboz	RS - 5135
封口膜号OM992	Fisher Scientific则	13-374-16
12和24孔板	长荣科学	222 - 8044 - 01F
Superfrost / PLUS显微镜载玻片	Fisher Scientific则	12-550-15
4ML明确小瓶	国家科学技术进步奖	B7800 - 2