Un método para etiquetar los Vasos sanguíneos en embriones de ratones

Resumen

En este artículo se describe un método para el etiquetado de la piel embrionaria y los vasos sanguíneos del timo.

Resumen

El establecimiento de una red de vasos sanguíneos funcionales es una parte esencial de la organogénesis, y es necesario para la función del órgano óptimo. Por ejemplo, en la formación de la vasculatura del timo y el patrón adecuado es esencial para la entrada en el órgano de timocitos y células T maduras salida a la periferia. La disposición espacial de los vasos sanguíneos en el timo depende de señales del microambiente local, es decir, las células epiteliales del timo (TEC). Varios informes recientes sugieren que la interrupción de las señales de estos resultados en un recipiente de ^1,2 defectos timo sangre. Estudios previos han descrito técnicas que se utilizan para etiquetar los ^1,2 timo vasculatura neonatal y de adultos. Se demuestra aquí una técnica para el etiquetado de los vasos sanguíneos en el timo embrionario. Este método combina el uso de FITC-dextrano o Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina I (GSL 1 - isolectina B ₄₎ inyecciones faciales vena y CD31 tinción de anticuerpos para identificar las estructuras vasculares del timo y PDGFR-β a la etiqueta del timo mesénquima perivascular ^3-5. La opción de utilizar cryosections o secciones vibratome también se proporciona. Este protocolo se puede utilizar para identificar el timo defectos vasculares, lo cual es crítico para la definición de los roles de TEC-moléculas derivadas del timo en la formación de vasos sanguíneos. Como el método de las etiquetas de todo el sistema vascular, también puede ser utilizado para analizar las redes vasculares en múltiples órganos y tejidos en todo el embrión, incluyendo la piel y el corazón de ^6-10.

Protocolo

1. Fluoresceína dextrano y GSL I-isolectina B ₄ inyecciones vena facial para etiquetar vasculatura embrionaria

1. Prepare FITC-dextrano (50ug/mL) en tampón fosfato salino (PBS) o GSL 1 - isolectina B ₄ (20ug/200uL) en PBS en un tubo Eppendorf 1,5 ml y calentar a 37 º C. Añadir 100uL de acciones de 1,25 Fast Green / PBS a la solución de FITC-dextrano (volumen total de 1 ml) y 180uL de acciones de 1,25 Fast Green / PBS a la GSL 1 - isolectina B ₄ (200uL volumen total), por lo que la solución es visiblemente azul.
2. Diseccionar E14.5 E18.5-embriones y el saco vitelino juntos, dejando el tallo alantoideo (arteria y vena umbilical) se mantienen intactas.
3. Transferencia de embriones a un nuevo plato de petri (60 x 15 mm) y sumérgelas en PBS a temperatura ambiente.
4. La posición del embrión para proporcionar una vista sagital de la cabeza / cara. El uso de micro pinza de disección para agarrar suavemente el embrión en la cabeza.
5. Utilizando una aguja 30G, se inyectan 50 ul FITC-dextrano (50ug/mL) o GSL 1 - isolectina B ₄ (20ug en 200uL PBS) en la vena facial, apuntando la aguja hacia la parte posterior de la cabeza.
6. Cuando el medio de contraste es visible en la vena umbilical, retire la aguja y por separado el embrión del tallo alantoideo (arteria umbilical y la vena).
7. Después de las inyecciones, permiten embrión a permanecer en PBS a temperatura ambiente durante 2-3 minutos para que el colorante circula por todo el embrión.

2. Todo el montaje análisis de la vascularización cutánea

1. Después de permitir que el medio de contraste a circular por todo el embrión, extraer muestras de la piel de las regiones de las extremidades, espalda y estómago, etc ^8,9.
2. Lavar la piel de la muestra en PBS frío, y fijar en el 4% PFA / PBS durante 2 horas ^8,9. Lavar 3 veces durante 10 minutos cada uno en un vial de 4 ml claro con 2 ml de PBS frío.
3. Coloque la muestra de piel en un microscopio de diapositivas y añadir 100 ml de montaje de los medios de comunicación en cada diapositiva y una cubierta de vidrio.
4. Permitir que se sequen en un área de almacenamiento en la oscuridad.
5. Continúe con el Paso sección 'Adquisición de imágenes "2.

3. Multi-color etiquetado de timo y los vasos sanguíneos del corazón y las células perivasculares de cryosections (Continúa de la Sección 1, Paso 7)

1. Embrión de todo 'Flash congelar en nitrógeno líquido. Los embriones se pueden y se almacenan a -80 ° C hasta su análisis.
2. Por otra parte, diseccionar el timo, el enjuague en PBS 4 ° C, y fijar en 2 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) / PBS durante 2 horas. Lavar 3 veces durante 10 minutos en PBS frío, lugar thymi en octubre, y congelar y almacenar hasta su uso a -80 ° C.
3. Para muestras criostáticas, se extendió en octubre 'block' y una sección de montaje en el embrión o los órganos diseccionados / tejidos para el corte.
4. Cortar el tejido congelado en 10 micras de espesor y se acumulan en las diapositivas.
5. Fix secciones en acetona durante 5-10 minutos. Lavar 3 veces en TBS frío.
6. Bloque en el burro 10% de suero / TBS en una cámara húmeda a temperatura ambiente.
7. Incubar las secciones de una hora durante la noche-con 100 l de anticuerpos primarios en una cámara húmeda a 4 ° C: en este ejemplo, el uso de rata anti-CD31 de ratón (1:100) al endotelio etiqueta, y de cabra anti-ratón PDGFR-β (1:100) para marcar a las células perivasculares. Es útil para cubrir las diapositivas individualmente cortar tiras Parafilm para asegurarse de que el anticuerpo se extienda uniformemente por toda la sección.
8. Después de la incubación con el anticuerpo primario, lave las secciones 3 veces en TBS frío. Incubar con 100 l de anticuerpos secundarios apropiados durante 30 minutos como mínimo.
9. Lavar 3 veces en TBS frío. Añadir 100 ml de montaje de los medios de comunicación en cada diapositiva y una cubierta de vidrio.
10. Permitir que se sequen en un área de almacenamiento en la oscuridad.
11. Pase a la sección 'Adquisición de imágenes ".

4. Multi-color de etiquetado de la vasculatura del timo y células perivasculares de las secciones vibratome (Continúa de la Sección 1, Paso 7)

1. Diseccionar los lóbulos del timo del embrión y enjuague con PBS frío.
2. Fix timo en el 4% PFA / PBS a temperatura ambiente durante 2 horas.
3. Se lavan con PBS-Triton X (0,15%) 3 veces, 10 minutos y thymi lugar en un cartucho de plástico y se sumergen en el 4% de baja fusión de agarosa / PBS (~ 4 ° C). El timo debe estar en contacto con la parte inferior del cartucho.
4. Permitir agarosa para solidificar en el hielo (3-5 minutos). Use una hoja de afeitar para cortar el exceso de agarosa. Añadir cola en el bloque de vibratome y adherirse al bloque de la muestra.
5. Añadir PBS frío a baño de agua vibratome hasta que la muestra y la hoja están inmersos.
6. Ajustar la velocidad y la amplitud (de gran amplitud y baja velocidad moderada es ideal para suaves secciones del timo). La amplitud debe ser reducida si las secciones romper debido a la agitación en exceso.
7. Corte secciones de 50 um.
8. Usando un pincel, recoger las secciones en una microplaca de 24 pocillos en PBS frío.
9. Secciones de bloque en 500 l de suero de burro del 10% en PBS-Triton X (0,15%) durante 30 minutos.
10. Secciones se incuban durante 8 horas o toda la noche con el anticuerpo primario, tales como anti-CD31 y anti-PDGFR β-, En una cubierta de 24 pocillos de microplacas.
11. Lavar 3 veces con PBS-Triton X (0,15%) sobre un total de 8 horas a 4 ° C.
12. Secciones de bloque en el suero de burro del 10% en PBS-Triton X (0,15%) durante 30 minutos.
13. Incubar las secciones de 8 horas a la noche a 4 ° C con anticuerpos secundarios apropiados.
14. Lavar 3 veces con PBS-Triton X (0,15%) sobre un total de 8 horas a 4 ° C.
15. Fijar de nuevo las muestras en el 4% PFA / PBS durante 30 minutos en hielo.
16. Lavar 3 veces con PBS-Triton X (0,15%) más de 30 minutos en hielo.
17. Deshidratar las muestras a través de una gradual MeOH / PBS Triton X-series: 25% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH, MeOH y 100% a los 10 minutos para cada paso. Reemplazar el 100% de MeOH con MeOH fresco después de 10 minutos y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente.
18. En un recipiente de vidrio, mezclar Babb (alcohol bencílico: benzoato de bencilo) en una proporción de 1:2. Combine Babb con MeOH para una concentración final del 50% Babb y el 50% MeOH. Incubar la muestra en Babb: MeOH durante 10-15 minutos.
19. Transferir la muestra a un recipiente de vidrio con 100% Babb y se incuba durante 10-15 minutos o hasta que sean borrados, a temperatura ambiente.
20. Llena de diapositivas depresión (0,7 mm de profundidad) con Babb fresca 100% y de transferencia de muestras a un lado. Añadir cubierta de vidrio (No. 1.5) y el sello con 2-3 capas de esmalte de uñas. Permita que el esmalte de uñas para endurecer en la oscuridad a temperatura ambiente, luego almacenar la muestra a 4 ° C.
    Nota: Las diapositivas deben estar completamente cerrados antes de la adquisición de la imagen confocal. Las imágenes deben ser adquiridas en 12-24 horas, como los tintes fluorescentes pueden desaparecer en Babb.
21. Pase a la sección 'Adquisición de imágenes ".

5. De adquisición de imágenes

1. Imagen 10 micras secciones congeladas con un microscopio confocal con el Plan-Apochromat 20X/0.8 objetivo (512 x 512 píxeles) con 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectina B _4), 543 - y 633-nm líneas láser.
2. Adquirir confocal z-secciones de la piel y montaje de todo 50 micras de agarosa embebido en secciones con el Plan-Apochromat 10X/0.4 objetivo (512 x 512 píxeles) con 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectina B _4), 543 -, y 633-nm líneas láser. De serie Z-secciones deben ser recogidos de forma secuencial en un micrones para cada canal correspondiente.
3. Reconstruir serie Z-secciones usando Zeiss Axiovision 4,6 u otro software de análisis de imagen.

6. Los resultados representativos:

Etiquetado de la eficiencia de la vasculatura embrionarias es crucial para la evaluación de los defectos de los vasos sanguíneos en embriones de ratones. La figura 1 muestra un etiquetado específico de los vasos sanguíneos del timo E16.5 (1A-B) y el etiquetado de cooperación con CD31 (1B), además de la tinción de los ventrículos derecho e izquierdo (1E-F), respectivamente. El GSL I-isolectina B ₄ protocolo para cryosections como se describe en las secciones 1, 3 y 5 se utilizó en estos experimentos. Todo el montaje de etiquetado de la red de vasos sanguíneos en la piel E16.5 ratones, utilizando los protocolos descritos en las secciones 1, 2 y 5 se muestra en la Figura 1C-D.

Figura 1 Leyenda. FITC GSL I - isolectina B ₄ inyecciones en la vena facial E16.5 embriones de ratón. criosección a. de timo embrionario después de la inyección. b. Fusión de CD31 co-etiquetado con isolectina B _4. c. y d. Todo el montaje de la inyección de la piel embrionaria vasculatura siguiente. e. y f. criosección de corazón embrionarias e. (derecha ventrículo) f. (ventrículo izquierdo) después de la inyección.

Discusión

Todo el montaje y PECAM-1 (CD31) en las secciones de tinción son los métodos convencionales para el etiquetado de la vasculatura en embriones de ratones. Estos métodos requieren el uso de la inmunofluorescencia directa y / o indirecta, y los detergentes para permeabilizar los tejidos del ratón. Este resulta ser un proceso más oportuna. En este caso, hemos empleado FITC-dextrano o isolectina B ₄ inyecciones vena facial para etiquetar directamente la vasculatura embrionaria, eliminando así la necesidad de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
FITC-dextrano	Sigma	FD150S-1G
Fluoresceína GSL 1 - isolectina B 4	Vector Laboratories	FL-1201
Fast Green	MP Biomedicals	195178
PFA	Fluka	76240
El suero fetal bovino	Atlanta Productos Biológicos	S11550
Compuesto óptimo de temperatura de corte (octubre	VWR	25608-930
Acetona	JT Baker	9006-33
Burro suero	Jackson	017-000-121
rata anti-ratón CD31,	BD Pharmingen	558736
cabra anti-ratón PDGFR-β	R & D Systems	AF1042
burro anti-CD31 de rata Alexa 647 (Invitrogen)	Biolegend	102516
burro de cabra anti-Alexa 594 (Invitrogen)	Invitrogen	A11058
Triton X -100	Sigma-Aldrich	X-100
Agarosa de bajo derretimiento / PBS	Sigma-Aldrich	A9414-25G
Metanol	Fisher Scientific	A413-4
El alcohol de bencilo	Acros Científico	148390010
Benzoato de bencilo	Acros Científico	105860010
Se desliza la depresión	Fisher Scientific	S175201
Fluorogel	Microscopía electrónica de Ciencias	17985-10
Cubierta de vidrio (22x22) -1,5	Thermo Scientific	152222
Zeiss LSM 510 Microscopio Confocal Meta	Zeiss
Micro pinza de disección	Roboz	RS-5135
Parafilm No. OM992	Fisher Scientific	13-374-16
12 y 24, así microplacas	Evergreen Científico	222-8044-01F
Superfrost / Plus Micropreparados	Fisher Scientific	12-550-15
4 ml viales claras	Nacional de Investigaciones Científicas	B7800-2