배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

요약

이 문서는 배아 피부와 thymus 혈관을 라벨에 대한 방법을 설명합니다.

초록

기능성 혈관 네트워크의 설립 organogenesis의 필수적인 부분이며, 최적의 장기의 기능이 필요합니다. 예를 들어, thymus 적절한 vasculature 형성과 patterning에있는 기관 및 주변에 성숙한 T 세포 출구로 thymocyte 입학 필수적입니다. thymus에서 혈관의 공간적 배열은 로컬 microenvironment의 신호, 즉 상피 세포 thymic (TEC)에 의존적일 수 밖에 없습니다. 몇 가지 최근의 보고서는 thymus 혈관 결함 ^1,2에서 이러한 신호 결과의 중단을 제안한다. 이전 연구는 신생아와 성인의 thymus vasculature ^{1,2 레이블을하는} 데 사용되는 기술을 설명합니다. 우리는 여기서 배아 thymus에서 혈관을 라벨에 대한 기술을 보여줍니다. 이 방법은 FITC - dextran 또는 Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia 렉틴 I (GSL 1 - isolectin B _4)의 사용을 결합한 얼굴 정맥 주사 및 CD31 항체 얼룩 thymus 혈관 구조와 thymic perivascular mesenchyme ^3-5 라벨 PDGFR - β를 식별할 수 있습니다. cryosections 또는 vibratome 섹션을 사용할 수있는 옵션도 제공됩니다. 이 프로토콜은 thymus 혈관 형성에 TEC - 파생 분자의 역할을 정의하는 것이 중요합니다 thymus 혈관 결함을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 방법은 전체 vasculature를 레이블로, 그것은 또한 피부와 마음 ^60-10 포함한 배아에 걸쳐 여러 기관과 조직에 혈관 네트워크를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 플루오레신는 dextran과 GSL I - isolectin B _네 얼굴 정맥 주사가 배아 vasculature를 라벨에 표시

1. isolectin B 1.5mL Eppendorf 튜브에 PBS에서 ₄ (20ug/200uL) 37에 따뜻한 ° C. - 인산에 FITC - dextran (50ug/mL)를 준비 식염수 (PBS) 또는 GSL 1 버퍼 그린 / PBS GSL 1 FITC - dextran 솔루션 (총 볼륨 1mL) 및 주식 1.25mM 빨리 180uL 주식 1.25mM 빠른 그린 / PBS의 100uL 추가 - isolectin 솔루션은되도록 B ₄ (총 볼륨 200uL) 눈에 파란색.
2. allantoic 스토킹 (제대 동맥과 정맥)은 그대로두고, 함께 E14.5 - E18.5 배아와 난황을 해부하다.
3. 새로운 petrie 요리 (60 X 15mm)로 배아를 전송하고 실온에서 PBS에 젖어.
4. 머리 / 얼굴의 화살보기를 제공하기 위해 배아를 놓습니다. 부드럽게 머리에있는 배아를 파악하기 위해 마이크로 해부 집게를 사용하십시오.
5. 30G 바늘을 사용 50uL FITC - dextran (50ug/mL) 또는 GSL 1 삽입 - isolectin B ₄ (200uL PBS에서 20ug)를 머리 뒤쪽 방향으로 바늘을 가리키는 얼굴 정맥에.
6. 염료가 제대 정맥에서 볼 때, 바늘을 제거하고 all​​antoic 스토킹 (제대 동맥과 정맥)에서 배아를 구분한다.
7. 주사 다음, 배아는 염료가 배아를 통해 순환되도록 2~3분에 대한 실온에서 PBS에 남아있을 수 있습니다.

2. 피부 vasculature 전체 마운트 분석

1. 염료는 배아에 걸쳐 순환 수 있도록 후, 다시, 사지의 지역에서 피부 샘플을 제거하고 복부 등 ^8,9.
2. 차가운 PBS의 피부 샘플을 씻고, 그리고 이시간 ^8,9에 대한 4% PFA / PBS에 수정. 십분 2mL 차가운 PBS로 4mL 명확 약병에 각각에 대해 3 번 씻으십시오.
3. 현미경에 놓습니다 스킨 샘플 100 각 슬라이드에 미디어를 장착의 μl와 커버 유리 슬라이드 및 추가합니다.
4. 슬라이드는 어두운 저장 영역에서 건조하도록 허용합니다.
5. 2 '이미지 수집'섹션 단계로 진행합니다.

3. thymus와 심장 vasculature 및 cryosections에 대한 perivascular 세포의 멀티 컬러 라벨은 (제 1, 7 단계에서 계속)

1. 액체 질소에서 '플래시 프리즈'전체 배아. 공룡의 태아가되며 -80 ° C에서 분석까지 저장할 수 있습니다.
2. 또는, thymus을 해부하다 4 ° C PBS로 씻어, 2 시간 동안 2mL 4 % Paraformaldehyde (PFA) / PBS에 수정. -80에서 사용 ° C. 때까지 차가운 PBS, 10에서 개최 thymi하고, 동결 및 상점에서 10 분 동안 3 번 씻으십시오
3. cryosectioning 들어, 섹션에서 '블록'에 OCT를 확산하고 sectioning에 대한 배아 또는 해부 기관 / 티슈를 탑재합니다.
4. 10 μm의 두께는 섹션으로 냉동 조직을 잘라 슬라이드에 수집합니다.
5. 50~10분위한 아세톤의 섹션을 수정. 추운 TBS에서 3 번 씻으십시오.
6. 실온에서 습도 챔버에서 10 % 당나귀 혈청 / TBS에 차단합니다.
7. 4 습도 챔버의 주요 항체 100 μl 1 1 시간 하루에 대한 섹션을 품어 ° C : 예제에서, 우리는 쥐의 반 마우스 CD31 (1:100) 라벨 내피하고, 염소 반 마우스 PDGFR - β를 사용하여 (1:100) perivascular 세포를 분류합니다. 이것은 항체가 균일 섹션에 걸쳐 확산되도록하기 위해 개별적으로 절단 Parafilm 스트립과 함께 슬라이드를 커버하는 데 유용합니다.
8. 주요 항체와 부화 다음, 차가운 TBS에서 섹션에게 3 회 씻는다. 최소 30 분 적절한 보조 항체의 100 μl로 품어.
9. 추운 TBS에서 3 번 씻으십시오. 100 각 슬라이드에 미디어를 장착의 μl와 덮개 유리를 추가합니다.
10. 슬라이드는 어두운 저장 영역에서 건조하도록 허용합니다.
11. '이미지 수집'섹션을 참조하십시오.

4. thymus vasculature 및 vibratome 섹션에 대한 perivascular 세포의 멀티 컬러 라벨은 (제 1, 7 단계에서 계속)

1. 배아로부터 thymus 엽 (叶)을 해부하다 차가운 PBS로 린스.
2. 2 시간 동안 실온에서 4% PFA / PBS에 thymus을 수정.
3. 용융 낮은 4%의 작은 플라스틱 카트리지와 잠수함의 PBS - 트리톤 X (0.15 %) 3 시간, 10 분 장소 thymi에 씻으 아가로 오스 / PBS (~ 4 ° C). thymus은 카트리지의 하단에 접촉해야합니다.
4. 아가로 오스는 얼음 (3~5분)에 응고 수 있습니다. 초과 아가로 오스를 잘라하기 위해 면도날을 사용합니다. vibratome 블록에 접착제를 추가하고 차단하는 샘플을 준수합니다.
5. 샘플 및 블레이드가 포장되어 때까지 vibratome 물을 욕조에 차가운 PBS를 추가합니다.
6. 속도와 진폭을 (높은 진폭과 낮은 중간 속도 소프트 thymus 섹션에 이상적입니다) 설정합니다. 섹션 초과 교반으로 인해 헤어질 경우 진폭은 감소한다.
7. 50 음 섹션을 잘라 버릴거야.
8. 붓을를 사용 차가운 PBS에 24 잘 microplate에 섹션을 수집합니다.
9. 30 분 동안 PBS - 트리톤 X에서 10 % 당나귀 혈청 (0.15 %) 500 μl의 블록 섹션.
10. 같은 차 항체와 함께 하루를 8 시간에 대해 품어 섹션 안티 CD31 및 안티 - PDGFR - β, 대상 24 잘 microplate 인치
11. 4 8 시간 총 ° C.여 PBS - 트리톤 X 3 회 (0.15 %)를 씻으십시오
12. 30 분 동안 PBS - 트리톤 X에서 10 % 당나귀 혈청 (0.15 %)에서 블록 섹션.
13. 4 ° C와 함께 적절한 보조 항체에 하루에 8 시간 섹션을 품어.
14. 4 8 시간 총 ° C.여 PBS - 트리톤 X 3 회 (0.15 %)를 씻으십시오
15. 다시 수정 샘플 4%에 PFA / 얼음에 30 분 PBS.
16. 얼음 30 분 이상의 PBS - 트리톤 X 3 회 (0.15 %)를 씻으십시오.
17. 25% MeOH, 50 % MeOH, 75 % MeOH, 각 단계를위한 10 분 100 % MeOH : 등급 MeOH / PBS - 트리톤 X 시리즈를 통해 샘플을 탈수. 십분 후에 신선한 MeOH로 100 % MeOH를 교체하고 실온에서 1 시간 품어.
18. 유리 용기에서 혼합 BABB (벤질 알코올 : 벤질 벤조 산) 1시 2분 비율 인치 50 % BABB와 50 % MeOH의 최종 농도에 대한 MeOH와 BABB을 결합합니다. 10-15분에 대한 MeOH : BABB에서 샘플을 품어.
19. 상온에서, 10-15 분 또는 정리 할때까지 백퍼센트 BABB과 부화로 유리 용기 샘플을 전송합니다.
20. 측면으로 신선한 100 % BABB 및 전송 샘플과 우울증 슬라이드 (0.7mm 깊이)를 입력합니다. 매니큐어로부터 2-3 코트와 유리 (제 1.5) 및 인감을 커버 추가합니다. 상온에서 어둠의 강화 매니큐어가 손톱 허용 후 4 샘플을 저장 ° C.
    참고 : 슬라이드가 완전히 공촛점 이미지 수집하기 전에 봉인해야합니다. 형광 염료가 BABB에 페이드 수있는 이미지는 12~24시간 이내에 취득해야합니다.
21. '이미지 수집'섹션을 참조하십시오.

5. 이미지 수집

1. 이미지 10 488과 계획 - 고차 색지움 20X/0.8 목표를 (512 X 512 픽셀)를 사용 공촛점 현미경으로 μm의 냉동 섹션 - (FITC-dextran/GSL 1 - B _사 isolectin), 543 -, 그리고 633 - NM 레이저 라인.
2. 공촛점 취득 전체 마운트 피부 및 50 μm의 488과 계획 - 고차 색지움 10X/0.4 목표를 (512 X 512 픽셀)를 사용하여 아가로 오스 - 임베디드 섹션의 Z - 섹션 - (FITC-dextran/GSL 1 - B _사 isolectin), 543 - 와 633 - nm의 레이저 라인. 시리얼 Z - 부분은 각 각 채널에 대해 1 미크론에서 순차적으로 수령해야합니다.
3. 자이스 혈구 Axiovision 4.6이나 기타 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 Z - 섹션을 직렬 재구성.

6. 대표 결과 :

배아 vasculature의 효율적인 라벨링은 배아 생쥐에서 혈관 결함을 평가하기위한 중요합니다. 그림 1은 각각 좌우 심실의 얼룩 (1E - F) 이외에 E16.5 thymus 혈관 (1A - B)와 CD31 (1B)와 함께 공동 상표, 특정 라벨을 보여줍니다. GSL I - isolectin B와 같은 섹션 1, 3, 5에 설명된 cryosections ₄ 프로토콜은 이러한 실험에 사용되었다. 전체 마운트 E16.5 생쥐의 피부 혈관 네트워크의 레이블, 섹션 1, 2에서 설명된 프로토콜을 사용하여, 5은 그림 1C - D에 표시됩니다.

한 전설을 그림. FITC GSL I - E16.5 마우스 배아에 isolectin B _네 얼굴 정맥 주사. 배아 피부 vasculature 다음 주입의 주입 다음 배아 thymus의 A.의 Cryosection. isolectin B ₄ CD31 공동 상표의 B. 병합합니다. C.와 D. 전체 마운트. E. 및 배아 심장의 E. F.의 Cryosection (오른쪽 뇌실) F. (뇌실 왼쪽) 다음과 같은 분사.

토론

섹션에서 전체 마운트 및 PECAM - 1 (CD31) 얼룩은 배아 생쥐에서 vasculature을 라벨에 대한 종래의 방법입니다. 이 방법은 직접 및 / 또는 간접 immunofluorescence와 마우스 조직을 permeabilize하기 위해 세제의 사용을 필요로합니다. 이것은 다소 적시에 처리하는 증명한다. 여기, 우리는 FITC - dextran 또는 isolectin B _사 안면 정맥 주사 직접함으로써 항체 라벨 단계에 대한 요구를 제거, 배아 vasculature 레이?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
FITC - dextran	시그마	FD150S - 1G
isolectin B 4 - 플루오레신는 GSL 1 분류	벡터 연구소	FL - 1201
빠른 그린	MP의 Biomedicals	195,178
PFA	Fluka	76,240
태아 소 혈청	애틀랜타 체액	S11550
최적의 절삭 온도 컴파 운드 (OCT	VWR	25608-930
아세톤	JT 베이커	9006-33
당나귀 세럼	잭슨	017-000-121
쥐 방지 마우스 CD31,	BD Pharmingen	558,736
염소 안티 마우스 PDGFR - β	R & D 시스템	AF1042
당나귀 안티 쥐 CD31 알렉사 647 (Invitrogen)	Biolegend	102,516
당나귀 안티 염소 알렉사 594 (Invitrogen)	Invitrogen	A11058
트리톤 X -100	시그마 - 올드 리치	X - 100
낮은 용융 아가로 오스 / PBS	시그마 - 올드 리치	A9414 - 25G
메탄올	피셔 과학	A413 - 4
벤질 알코올	Acros 과학	148,390,010
벤질 벤조 산	Acros 과학	105,860,010
우울증 슬라이드	피셔 과학	S175201
Fluorogel	전자 현미경 과학	17985-10
커버 유리 (22X22) -1.5	써모 과학	152,222
자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 현미경	자이스 혈구
마이크로 해부 포셉	Roboz	RS - 5135
Parafilm 번호 OM992	피셔 과학	13-374-16
12 24 잘 microplates	에버그린 과학	222-8044 - 01F
Superfrost / 플러스 현미경 슬라이드	피셔 과학	12-550-15
4mL 맑은 튜브	국립 과학	B7800 - 2