Um método para Etiquetagem Vascularização no embrião do rato

Resumo

Este artigo descreve um método para a rotulagem de pele embrionária e vasos sanguíneos do timo.

Resumo

O estabelecimento de uma rede funcional dos vasos sanguíneos é uma parte essencial da organogênese, e é necessário para a função do órgão ideal. Por exemplo, na formação adequada vascularização do timo e padronização é essencial para a entrada timócito no órgão e saída de células T maduras para a periferia. O arranjo espacial dos vasos sanguíneos no timo é dependente de sinais a partir do microambiente local, ou seja, células epiteliais tímicas (TEC). Vários relatórios recentes sugerem que a interrupção desses resultados no timo sinais de sangue ^1,2 defeitos navio. Estudos anteriores descreveram técnicas usadas para rotular os ^1,2 vasculatura neonatal e adulto timo. Nós demonstramos aqui uma técnica para a rotulagem dos vasos sanguíneos no timo embrionárias. Este método combina o uso de FITC-dextran ou Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectina I (GSL 1 - isolectin B ₄₎ injeções veia facial e coloração de anticorpos CD31 para identificar timo estruturas vasculares e PDGFR-β para rotular tímica perivascular mesênquima ^3-5. A opção de usar ou seções criosecções vibratome também é fornecido. Este protocolo pode ser usado para identificar defeitos do timo vascular, que é crítico para a definição dos papéis dos TEC derivadas moléculas na formação do timo dos vasos sanguíneos. Como o método de rótulos toda a vasculatura, ele também pode ser usado para analisar as redes vascular em vários órgãos e tecidos em todo o embrião, incluindo pele e do coração ^60-10.

Protocolo

1. Fluoresceína rotulados dextran e GSL I-isolectin B ₄ injeções veia facial para rotular vasculatura embrionárias

1. Prepare FITC-dextran (50ug/mL) em tampão fosfato salino (PBS) ou GSL 1 - isolectin B ₄ (20ug/200uL) em PBS em um tubo Eppendorf 1,5 ml e aquecer a 37 ° C. Adicionar 100uL de estoque 1,25 mM Fast Green / PBS para a solução FITC-dextran (volume total de 1ml) e 180uL de estoque 1,25 mM Fast Green / PBS a um GSL - isolectin B ₄ (200uL volume total), de modo que a solução é visivelmente azul.
2. E14.5-E18.5 dissecar embriões e saco vitelino juntos, deixando o talo alantóide (artéria e veia umbilical) intacta.
3. Transferência de embriões para um prato novo Petrie (60 X 15 mm) e mergulha-as na PBS em temperatura ambiente.
4. Posição do embrião para fornecer uma visão sagital da cabeça / face. Use uma pinça de dissecação micro suavemente para entender o embrião na cabeça.
5. Usando uma agulha 30G, injetar 50uL FITC-dextran (50ug/mL) ou GSL 1 - isolectin B ₄ (20ug em 200uL PBS) na veia facial apontando a agulha para a parte traseira da cabeça.
6. Quando a tintura é visível na veia umbilical, retire a agulha e separar o embrião do talo alantóide (artéria e veia umbilical).
7. Após as injeções, permitem embrião permanecer em PBS à temperatura ambiente por 2-3 minutos para que o corante circula por todo o embrião.

2. Todo-mount análise da vascularização da pele

1. Depois de permitir que o corante para circular por todo o embrião, retire amostras de pele das regiões dos membros, costas e estômago, etc ^8,9.
2. Lavar amostra de pele no frio PBS, e fixar em 4% PFA / PBS por 2 horas ^8,9. Lavar 3 vezes durante 10 minutos cada, em frasco com 2 ml clara 4mL frio PBS.
3. Colocar a amostra de pele em um microscópio de slides e adicione 100 ml de montagem de mídia para cada slide e uma tampa de vidro.
4. Permitir slides para secar em uma área de armazenamento.
5. Vá para a Etapa seção "Aquisição de Imagem" 2.

3. Multi-cor rotulagem de timo e vascularização do coração e células perivascular para criosecções (Continue da Seção 1, Passo 7)

1. Embrião 'Flash congelar "todo em nitrogênio líquido. Embriões podem ser e armazenadas a -80 ° C até a análise.
2. Alternativamente, dissecar timo, enxágüe em 4 ° C PBS, e fixar em 2 mL paraformaldeído 4% (PFA) / PBS por 2 horas. Lavar 3 vezes durante 10 minutos no frio PBS, thymi lugar em outubro, e congelar e armazenar até usar a -80 ° C.
3. Para cryosectioning, espalhados em outubro 'block' uma seção e montar o embrião ou órgãos dissecados / tecidos para corte.
4. Corte de tecido congelado em 10 mM de espessura e recolher em slides.
5. Fix seções em acetona por 5-10 minutos. Lavar 3 vezes em TBS frio.
6. Bloco em 10% de soro de burro / TBS em uma câmara de umidade em temperatura ambiente.
7. Incubar seções de 1 hora durante a noite com 100 ul de anticorpos primários em câmara úmida a 4 ° C: neste exemplo, usamos ratos anti-rato-CD31 (1:100) ao endotélio rótulo, e de cabra anti-rato PDGFR β- (1:100) para rotular as células perivascular. É útil para cobrir slides com tiras cortadas individualmente Parafilm para garantir que o anticorpo é uniformemente distribuídos em toda a seção.
8. Após a incubação com o anticorpo primário, lave seções 3 vezes em TBS frio. Incube com 100 ul de anticorpos secundários apropriada por 30 minutos mínimo.
9. Lavar 3 vezes em TBS frio. Adicione 100 ml de montagem de mídia para cada slide e uma tampa de vidro.
10. Permitir slides para secar em uma área de armazenamento.
11. Vá para a seção "Aquisição de Imagem".

4. Multi-cor rotulagem de timo vascularização e células perivascular para seções vibratome (Continue da Seção 1, Passo 7)

1. Dissecar lobos do timo, do embrião e enxaguar em água fria PBS.
2. Fix timo em 4% PFA / PBS em temperatura ambiente por 2 horas.
3. Lavar em PBS-Triton X (0,15%) 3 vezes, 10 minutos e thymi lugar em um cartucho de plástico pequeno e submergir em 4% baixo derreter agarose / PBS (~ 4 ° C). Timo deve estar em contato com a parte inferior do cartucho.
4. Permitir agarose para solidificar em gelo (3-5 minutos). Use uma lâmina de barbear para cortar o excesso de agarose. Adicionar cola no bloco vibratome e aderir ao bloco de amostra.
5. Adicionar frio PBS para vibratome banho-maria até que a amostra ea lâmina estão imersos.
6. Definir a velocidade e amplitude (amplitude de alta e baixa velocidade moderada é ideal para o soft seções timo). A amplitude deve ser reduzida se as seções quebrar devido à agitação em excesso.
7. Corte de 50 seções um.
8. Usando um pincel, recolher seções em uma microplaca de 24 poços no frio PBS.
9. Seções de bloco em 500 l de soro de burro de 10% em PBS-Triton X (0,15%) por 30 minutos.
10. Seções incubar por 8 horas durante a noite com o anticorpo primário, tais como anti-CD31 e anti-PDGFR-β, Em uma coberta de microplacas de 24 poços.
11. Lavar 3 vezes em PBS-Triton X (0,15%) sobre um total de 8 horas a 4 ° C.
12. Seções de bloco no soro de burro de 10% em PBS-Triton X (0,15%) por 30 minutos.
13. Incubar seções de oito horas durante a noite a 4 ° C com anticorpos secundários apropriado.
14. Lavar 3 vezes em PBS-Triton X (0,15%) sobre um total de 8 horas a 4 ° C.
15. Re-fix amostras em PFA 4% / PBS por 30 minutos no gelo.
16. Lavar 3 vezes em PBS-Triton X (0,15%) mais de 30 minutos no gelo.
17. Desidratar as amostras através de um classificado MeOH / PBS-Triton X série: 25% MeOH, MeOH 50%, 75% MeOH, MeOH e 100% menos 10 minutos para cada etapa. Substituir MeOH 100% com MeOH fresco depois de 10 minutos e incubar por 1 hora em temperatura ambiente.
18. Em um recipiente de vidro, misture Babb (Benzyl Álcool: benzoato de benzila) em uma proporção de 1:2. Combine Babb com MeOH para uma concentração final de Babb 50% e MeOH 50%. Incubar a amostra em Babb: MeOH por 10-15 minutos.
19. Transferência da amostra para um recipiente de vidro com 100% de Babb e incubar por 10-15 minutos ou até eliminado, em temperatura ambiente.
20. Preencha deslize depressão (0,7 milímetros de profundidade) com Babb 100% frescos e de transferência de amostra para o lado. Adicionar tampa de vidro (n º 1.5) e selar com 2-3 camadas de unha polonês. Permitir unha polonês para endurecer no escuro à temperatura ambiente, em seguida, armazenar amostras a 4 ° C.
    Nota: Os slides devem ser completamente selados antes da aquisição da imagem confocal. As imagens devem ser adquiridas dentro de 12-24 horas, como corantes fluorescentes podem desaparecer em Babb.
21. Vá para a seção "Aquisição de Imagem".

5. Aquisição de imagem

1. Imagem 10 mM cortes congelados com um microscópio confocal utilizando o Plano de Apochromat-20X/0.8 objetivo (512 X 512 pixels) com 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B _4), 543 -, e as linhas 633-nm laser.
2. Adquirir confocal z-seções da pele montagem inteira e 50 mm de agarose-embedded seções usando o Plano Apochromat-10X/0.4 objetivo (512 X 512 pixels) com 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B _4), 543 -, e 633 nm linhas laser. Série Z-seções devem ser coletadas sequencialmente em 1-micron para cada respectivo canal.
3. Reconstruir série Z-seções usando Zeiss Axiovision 4.6 ou software de análise de imagem.

6. Resultados representativos:

Rotulagem eficiente da vasculatura embrionárias é fundamental para avaliar os defeitos dos vasos sanguíneos em ratos embrionárias. A Figura 1 mostra a rotulagem específica de E16.5 vasos sanguíneos timo (1A-B) e co-rotulagem com CD31 (1B), além da coloração dos ventrículos direito e esquerdo (1E-F), respectivamente. A GSL I-B ₄ isolectin protocolo para criosecções conforme descrito nas seções 1, 3 e 5 foi usado nesses experimentos. Todo-mount rotulagem da rede navio pele sangue em ratos E16.5, utilizando os protocolos descritos nos pontos 1, 2 e 5 é mostrado na Figura 1C-D.

Figura 1 Legend. FITC GSL I - isolectin B ₄ injeções em veia facial E16.5 embriões de camundongos. a. Cryosection do timo embrionárias após a injecção. b. direta de CD31 co-rotulagem com B isolectin _4. c. e d. Whole-mount da injeção embrionárias da pele vasculatura seguinte. e. e f. Cryosection embrionárias de coração e. (à direita ventrículo) f. (ventrículo esquerdo) após a injecção.

Discussão

Todo o monte e PECAM-1 (CD31) coloração em cortes são os métodos convencionais para a rotulagem da vasculatura embrionárias em camundongos. Estes métodos requerem o uso de imunofluorescência direta e / ou indireta, e detergentes para permeabilizar o tecido mouse. Isso prova a ser um processo bastante oportuna. Aqui, nós empregamos FITC-dextran ou isolectin B ₄ injeções veia facial diretamente rótulo a vasculatura embrionárias, eliminando a exigência de rotulagem passos de anticorpos. Além disso,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
FITC-dextran	Sigma	FD150S-1G
Fluoresceína rotulados GSL 1 - B isolectin 4	Vector Laboratories	FL-1201
Verde rápido	Biomedicals MP	195178
PFA	Fluka	76240
Soro fetal bovino	Atlanta Biologicals	S11550
Composto Temperatura ideal de corte (OCT	VWR	25608-930
Acetona	JT Baker	9006-33
Donkey Serum	Jackson	017-000-121
rato anti-CD31 do mouse,	BD PharMingen	558736
cabra anti-rato PDGFR β-	R & D Systems	AF1042
donkey anti-CD31 rato Alexa 647 (Invitrogen)	Biolegend	102516
burro anti-cabra Alexa 594 (Invitrogen)	Invitrogen	A11058
Triton X -100	Sigma-Aldrich	X-100
Baixo derreter agarose / PBS	Sigma-Aldrich	A9414-25G
Metanol	Fisher Scientific	A413-4
Álcool benzílico	Acros Scientific	148390010
Benzoato de benzila	Acros Scientific	105860010
Slides depressão	Fisher Scientific	S175201
Fluorogel	Microscopia Eletrônica de Ciências	17985-10
Cobertura de vidro (22x22) -1,5	Thermo Scientific	152222
Zeiss LSM 510 Meta Microscópio Confocal	Zeiss
Micro pinça de dissecação	Roboz	RS-5135
Parafilm No. OM992	Fisher Scientific	13-374-16
12 e 24 microplacas bem	Scientific Evergreen	222-8044-01F
Superfrost / Plus Lâminas de Microscopia	Fisher Scientific	12-550-15
4mL frascos claros	Científica Nacional	B7800-2