שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים

Summary

מאמר זה מתאר שיטה תיוג עור וכלי דם עובריים התימוס.

Abstract

הקמתה של רשת כלי דם תפקודית הוא חלק חיוני של organogenesis, והוא נחוץ לצורך תפקוד האיבר אופטימלית. לדוגמה, במבנה vasculature התימוס נכונה דפוסים חיונית כניסה thymocyte לתוך איבר ויציאה בוגרת T-cell לפריפריה. הסידור המרחבי של כלי הדם התימוס תלוי אותות microenvironment המקומית, כלומר בתאי אפיתל הרתי (TEC). הדיווחים האחרונים מצביעים על כך מספר שיבוש תוצאות אלו אותות כלי דם התימוס ^1,2 פגמים. מחקרים קודמים תיארו טכניקות המשמשים התווית התימוס ילודים ומבוגרים ^1,2 vasculature. אנו מדגימים כאן טכניקה תיוג כלי הדם התימוס עובריים. שיטה זו משלבת את השימוש FITC-dextran או Griffonia (Bandeiraea) לקטינים Simplicifolia אני (GSL 1 - isolectin B ₄₎ זריקות וריד הפנים CD31 מכתים נוגדן לזהות מבנים וסקולרית התימוס ועל PDGFR-β לתייג הרתי perivascular mesenchyme ^3-5. האפשרות של שימוש cryosections או חלקים vibratome הוא גם סיפק. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות מומים בכלי הדם התימוס, שהוא קריטי עבור הגדרת התפקידים של TEC-derived מולקולות היווצרות כלי דם התימוס. כפי שיטת התוויות vasculature כולו, זה יכול לשמש גם כדי לנתח את רשתות כלי דם באיברים ורקמות רבות ברחבי העובר כולל העור לב ^6-10.

Protocol

1. והעמסת שכותרתו dextran ו-GSL אני isolectin ב ₄ זריקות וריד הפנים לתייג vasculature עובריים

1. הכן FITC-dextran (50ug/mL) ב בופר פוספט (PBS) או GSL 1 - isolectin B ₄ (20ug/200uL) ב-PBS בצינור Eppendorf 1.5mL וחם עד 37 ° C. הוסף 100uL מניות 1.25mM מהיר ירוק / PBS לפתרון FITC-dextran (הנפח הכולל 1mL) ו 180uL מניות 1.25mM מהיר ירוק / PBS עד 1 GSL - isolectin B ₄ (200uL הנפח הכולל), ולכן הפתרון הוא כחול בעליל.
2. לנתח E14.5-E18.5 עוברים שק החלמון יחד, עוזב את גבעול allantoic (עורק הטבור וריד) ללא פגע.
3. העברת עוברים לצלחת פטרי חדש (60 X 15 מ"מ) לטבול אותם PBS בטמפרטורת החדר.
4. מקם את העובר כדי לספק מבט sagittal הראש / פנים. שימוש במלקחיים לנתח מיקרו בעדינות לתפוס את העובר בראש.
5. באמצעות מחט 30G, להזריק 50uL FITC-dextran (50ug/mL) או GSL 1 - isolectin B ₄ (ב 20ug 200uL PBS) לווריד הפנים מכוון את המחט לכיוון החלק האחורי של הראש.
6. כאשר צבע גלוי בווריד הטבור, להוציא את המחט ולהפריד את העובר מן גבעול allantoic (עורק הטבור וריד).
7. בעקבות זריקות, לאפשר לעובר להישאר PBS בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות כדי לצבוע זורם לאורך העובר.

2. Whole-Mount ניתוח בכלי הדם בעור

1. לאחר המאפשר לצבוע לזרום לאורך העובר, להסיר דגימות עור מאזורים של הגפיים, הגב, הבטן וכו ^'8,9.
2. לשטוף מדגם העור בקור PBS, ולתקן 4% PFA / PBS למשך 2 שעות ^8,9. לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות כל בקבוקון ברור 4mL עם 2ml קר PBS.
3. מניחים על עור מדגם מיקרוסקופ שקופיות ולהוסיף 100 μl של הרכבה התקשורת כל שקופית וכוס לכסות.
4. אפשר שקופיות יבש באזור אחסון כהה.
5. המשך שלב בסעיף "רכישת תמונות" 2.

3. רב צבע תיוג של התימוס ועל vasculature לב ותאי perivascular עבור cryosections (המשך של סעיף 1, שלב 7)

1. העובר כולו "פלאש להקפיא" בחנקן נוזלי. עוברים יכולים להיות מאוחסנים ב -80 ° C עד הניתוח.
2. לחלופין, לנתח את בלוטת התימוס, לשטוף ב 4 ° C PBS, ולתקן ב Paraformaldehyde 2ml 4% (PFA) / PBS למשך 2 שעות. שטוף 3 פעמים למשך 10 דקות בקור PBS, מקום thymi ב אוקטובר, ולהקפיא ולאחסן עד השימוש ב -80 ° C.
3. עבור cryosectioning, להפיץ אוקטובר על "הבלוק" קטע והר את העובר או באיברים גזור / רקמות עבור חתך.
4. גזור הרקמה הקפואה אל תוך 10 חלקים עבים מיקרומטר ולאסוף בשקופיות.
5. תיקון הסעיפים אצטון למשך 5-10 דקות. לשטוף 3 פעמים TBS קר.
6. חסום חמור בדם 10% / כפות בתא לחות בטמפרטורת החדר.
7. לדגור על סעיפים 1 שעה לילה עם 100 μl של נוגדנים העיקרי בתא לחות על 4 מעלות צלזיוס: בדוגמה זו, אנו משתמשים עכברוש אנטי עכבר CD31 (1:100) על האנדותל, תווית עז אנטי עכבר PDGFR-β (1:100) לתייג תאים perivascular. כדאי לכסות שקופיות עם לחתוך בנפרד רצועות Parafilm כדי להבטיח את הנוגדן היא התפשטה באופן אחיד על פני הקטע.
8. לאחר הדגרה עם נוגדן ראשוני, לשטוף סעיפים 3 פעמים TBS קר. דגירה עם 100 μl של נוגדנים משני מתאים במשך 30 דקות מינימום.
9. לשטוף 3 פעמים TBS קר. הוסף 100 μl של הרכבה התקשורת כל שקופית וכוס לכסות.
10. אפשר שקופיות יבש באזור אחסון כהה.
11. המשך לסעיף "ייבוא ​​תמונות".

4. רב צבע תיוג של התימוס בכלי הדם ותאי perivascular עבור חלקים vibratome (המשך של סעיף 1, שלב 7)

1. לנתח את אונות התימוס מעובר ולשטוף בקור PBS.
2. תקן התימוס ב 4% PFA / PBS בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
3. לשטוף ב-PBS טריטון X (0.15%) 3 פעמים, 10 דקות thymi מקום מחסנית פלסטיק לצלול קטן ב -4% נמוך להמיס agarose / PBS (~ 4 ° C). התימוס צריך להיות במגע עם החלק התחתון של המחסנית.
4. אפשר agarose לבסס על הקרח (3-5 דקות). השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך agarose עודף. הוסף דבק כדי לחסום את vibratome לדבוק מדגם לחסום את.
5. הוסף קר PBS לאמבטיה מים vibratome עד המדגם להב שקועים.
6. קביעת מהירות משרעת (אמפליטודה גבוהה נמוכה בינונית מהירות הוא אידיאלי עבור חלקים התימוס רך). משרעת צריך להיות מופחת אם חלקים להתפרק עקב תסיסה עודף.
7. חותכים 50 מקטעים אממ.
8. בעזרת מכחול, לאסוף מקטעים microplate 24 באר בקור PBS.
9. בלוק הסעיפים 500 μl של נסיוב חמור של 10% טריטון X-PBS (0.15%) במשך 30 דקות.
10. סעיפים דגירה עבור 8 שעות לילה עם נוגדן ראשוני, כגון אנטי CD31 ואנטי PDGFR-β, ב microplate 24-מכוסה היטב.
11. לשטוף 3 פעמים ב-PBS טריטון X (0.15%) על סך של 8 שעות 4 ° C.
12. בלוק סעיפים בסרום חמור של 10% טריטון X-PBS (0.15%) במשך 30 דקות.
13. דגירה חלקים עבור 8 שעות הלילה ב 4 ° C עם נוגדנים משני המתאים.
14. לשטוף 3 פעמים ב-PBS טריטון X (0.15%) על סך של 8 שעות 4 ° C.
15. Re-לתקן דגימות 4% PFA / PBS במשך 30 דקות על הקרח.
16. לשטוף 3 פעמים ב-PBS טריטון X (0.15%) מעל 30 דקות על הקרח.
17. מייבשים דגימות דרך מדורגת MeOH / PBS-טריטון X סדרה: 25% MeOH, MeOH 50%, MeOH 75% ו 100% MeOH ב 10 דקות לכל שלב. החלף MeOH 100% עם MeOH טרי אחרי 10 דקות לדגור במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
18. במיכל זכוכית, לערבב באב (בנזיל אלכוהול: בנזיל בנזואט) ביחס 1:02. שלב באב עם MeOH ריכוז סופי של 50% ו באב MeOH 50%. דגירה המדגם באב: MeOH במשך 10-15 דקות.
19. העברת דגימת למיכל זכוכית עם 100% ו באב דגירה במשך 10-15 דקות או עד פינה, בטמפרטורת החדר.
20. מלא שקופיות דיכאון (0.7mm עומק) עם באב 100% טרי מדגם להעביר לצד. מוסיפים כיסוי זכוכית (מס '1.5) ואת החותם עם 2-3 שכבות של לק. אפשר לק להקשיח בחושך בטמפרטורת החדר, ואז לאחסן מדגם ב 4 ° C.
    הערה: שקופיות חייב להיות אטום לחלוטין לפני רכישת התמונה confocal. תמונות צריך להירכש בתוך 12-24 שעות, כמו צבעי ניאון יכול להמוג באב.
21. המשך לסעיף "ייבוא ​​תמונות".

5. תמונה הרכישה

1. תמונה 10 מיקרומטר חלקים קפואים עם מיקרוסקופ confocal באמצעות תכנית-Apochromat 20X/0.8 אובייקטיבי (512 X 512 פיקסלים) עם 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin ב _'4), 543 -, ו - 633 ננומטר קווי לייזר.
2. רוכשת confocal Z-קטעים של העור הר שלם 50 מיקרומטר agarose-משובצים קטעים באמצעות תכנית-Apochromat 10X/0.4 אובייקטיבי (512 X 512 פיקסלים) עם 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin ב _'4), 543 -, ו 633 ננומטר קווי לייזר. Serial-Z קטעי יש לאסוף באופן רציף עבור כל ערוץ בהתאמה ב 1 מיקרון.
3. לשחזר סדרתי Z-קטעים באמצעות Zeiss AxioVision 4.6 או תוכנות אחרות ניתוח התמונה.

6. נציג תוצאות:

תיוג יעיל של כלי הדם העוברי היא קריטית להערכת פגמים כלי דם בעכברים עובריים. איור 1 מציג תוויות ספציפיים של כלי הדם E16.5 התימוס (1A-B) ושיתוף עם תיוג CD31 (1B), בנוסף מכתים של החדרים, ימין ושמאל (1E-F), בהתאמה. I-GSL isolectin B ₄ פרוטוקול cryosections כמתואר בסעיפים 1, 3 ו 5 שימש בניסויים אלו. Whole-Mount תיוג של רשת כלי דם בעור E16.5 על עכברים, באמצעות פרוטוקולים המתוארים בסעיפים 1, 2, ו -5 מוצג באיור 1C-D.

איור 1 מקרא. FITC GSL אני - isolectin ב ₄ זריקות לתוך וריד הפנים E16.5 עוברי עכברים. Cryosection א של התימוס עובריים לאחר ההזרקה. b. מיזוג של CD31 במשותף עם תיוג B isolectin _4. ג ו - ד Whole-mount של הזרקת vasculature עובריים העור הבאה. e. ו Cryosection ו עובריים של הלב ה (מימין החדר) ו (משמאל החדר) הזריקה הבאה.

Discussion

Whole-mount ו PECAM-1 (CD31) מכתים על הסעיפים הם בשיטות המקובלות על תיוג vasculature בעכברים עובריים. שיטות אלו דורשים שימוש immunofluorescence ישיר ו / או עקיף, דטרגנטים כדי permeabilize רקמות העכבר. זה מוכיח להיות תהליך עדכני למדי. הנה, יש לנו עובדים FITC-dextran או isolectin ב ₄ זריקות וריד הפנים ישירות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
FITC-dextran	סיגמא	FD150S-1G
והעמסת שכותרתו GSL 1 - ב 4 isolectin	וקטור מעבדות	FL-1201
מהיר גרין	MP Biomedicals	195178
PFA	Fluka	76240
סרום שור עוברית	אטלנטה הביולוגיים	S11550
מתחם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר	VWR	25608-930
אצטון	JT בייקר	9006-33
חמור סרום	ג'קסון	017-000-121
עכברוש אנטי עכבר CD31,	BD Pharmingen	558736
אנטי עכבר עז PDGFR-β	R & D מערכות	AF1042
חמור נגד חולדה CD31 Alexa 647 (Invitrogen)	Biolegend	102516
חמור נגד עז Alexa 594 (Invitrogen)	Invitrogen	A11058
טריטון X -100	Sigma-Aldrich	X-100
נמוכה להמיס agarose / PBS	Sigma-Aldrich	A9414-25 גרם
מתנול	פישר סיינטיפיק	A413-4
בנזיל אלכוהול	Acros מדעי	148390010
בנזיל בנזואט	Acros מדעי	105860010
דיכאון שקופיות	פישר סיינטיפיק	S175201
Fluorogel	מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים	17985-10
כיסוי זכוכית (22X22) -1.5	Thermo Scientific	152222
Zeiss LSM 510 מיקרוסקופ Meta Confocal	Zeiss
מלקחיים לנתח Micro	Roboz	RS-5135
Parafilm מס 'OM992	פישר סיינטיפיק	13-374-16
12 ו 24 microplates היטב	אוורגרין מדעי	222-8044-01F
Superfrost / פלוס מיקרוסקופ שקופיות	פישר סיינטיפיק	12-550-15
4mL צלוחיות ברור	לאומית מדעי	B7800-2