Метод маркировки сосудистую в эмбриональных мышей

Резюме

В этой статье описывается метод для маркировки эмбрионального тимуса кожи и кровеносных сосудов.

Аннотация

Создание функциональной сети кровеносных сосудов является неотъемлемой частью органогенеза, и необходим для оптимального функционирования органа. Например, в тимусе правильного формирования сосудистой и структурирование имеет важное значение для тимоцитов вступления в органе и зрелых Т-клеток с выходом на периферию. Пространственное расположение кровеносных сосудов в вилочковой железе зависит от сигналов от местных микросреды, а именно эпителиальных клеток тимуса (TEC). Некоторые недавние сообщения предполагают, что нарушение этих сигналов приводит к тимус ^1,2 кровеносного сосуда дефектов. Предыдущие исследования описаны методы, используемые для обозначения новорожденных и взрослых тимуса сосудистой ^1,2. Мы демонстрируем здесь технику для маркировки кровеносных сосудов в эмбриональный тимус. Этот метод сочетает в себе использование FITC-декстран или Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Лектин I (GSL 1 - isolectin B ₄₎ лица инъекции вену и CD31 антител окрашивания для выявления сосудистых структур тимуса и PDGFR-β для обозначения тимуса периваскулярных мезенхимы ^3-5. Возможность использования cryosections или vibratome разделы также предоставляется. Этот протокол может быть использован для идентификации тимуса сосудистых дефектов, которое имеет решающее значение для определения роли TEC полученных молекул в тимусе образование кровеносных сосудов. Как метод этикетках всей сосудистой сети, он также может быть использована для анализа сосудистой сети в различных органах и тканях по всему эмбриона в том числе кожи и сердца ^6-10.

протокол

1. Fluorescein помечены декстрана и GSL I-isolectin B ₄ лица инъекции вену для обозначения эмбрионального сосудистую

1. Подготовка FITC-декстрана (50ug/mL) в фосфатно-солевым буфером (PBS) или GSL 1 - isolectin B ₄ (20ug/200uL) в PBS в 1,5 мл пробирку Эппендорфа и теплой до 37 ° C. Добавить 100 мкл акций 1,25 мм Быстрый зеленый / PBS для FITC-декстран решение (общий объем 1 мл) и 180uL акций 1,25 мм Быстрый зеленый / PBS, чтобы GSL 1 - isolectin B ₄ (всего 200uL объем), так что решение заметно синий.
2. Рассеките E14.5-E18.5 эмбриона и желточного мешка вместе, оставив аллантоисных стебля (пупочной артерии и вены) без изменений.
3. Трансфер эмбрионов на блюде новый Петри (60 X 15 мм) и погрузить их в PBS при комнатной температуре.
4. Позиция эмбриона обеспечить сагиттальной зрения головы / лица. Использование микро рассекает пинцетом аккуратно понять эмбриона на голову.
5. Использование 30G иглу, вводят 50uL FITC-декстрана (50ug/mL) или GSL 1 - isolectin B ₄ (20ug в 200uL PBS) в лице вену иглу указывая в направлении задней части головы.
6. Когда краска видна в пупочной вены, удалить иглу и отдельных эмбриона от аллантоисных стебля (пупочной артерии и вены).
7. После инъекции, позволяющие эмбриона остаться в PBS при комнатной температуре в течение 2-3 минут, так что краситель циркулирует по всему эмбриону.

2. Всего монтажа анализ кожи сосудистую

1. После учета красителя циркулируют по всему эмбриона, удалять образцы кожи из регионов конечностей, спины и живота, и т.д. ^8,9.
2. Промыть образец кожи в холодное PBS, и зафиксировать в 4% PFA / PBS в течение 2 часов ^8,9. Промыть 3 раза по 10 минут каждый в 4 мл ясно флакон с 2 мл холодного PBS.
3. Место образец кожи на предметное стекло и добавляют 100 мкл монтаж средств массовой информации к каждому слайду и покровного стекла.
4. Разрешить слайды сушить в темном месте хранения.
5. Перейдите к шагу разделе "Image Acquisition '2.

3. Многоцветный маркировки тимуса и сердца сосуды и периваскулярные клетки для cryosections (Continue из раздела 1, шаг 7)

1. Весь 'Flash заморозить »эмбриона в жидком азоте. Эмбрионы могут быть и хранили при температуре -80 ° С до анализа.
2. Кроме того, рассекать из тимуса, промыть в 4 ° C PBS, и исправить в 2 мл 4% Параформальдегид (PFA) / PBS в течение 2 часов. Промыть 3 раза в течение 10 минут в холодной PBS, место thymi в октябре, и заморозить и хранить до использования при -80 ° C.
3. Для cryosectioning, распространение октября на "блок" раздел и смонтировать эмбриона или расчлененные органов / тканей для секционирования.
4. Вырезать замороженной ткани в 10 мкм разделы и собирать на слайдах.
5. Fix разделы в ацетоне в течение 5-10 минут. Промыть 3 раза в холодной TBS.
6. Блок в 10% сыворотки осла / TBS в камере влажности при комнатной температуре.
7. Инкубируйте разделы в течение 1 часа, в течение ночи с 100 мкл первичных антител в камере влажности при температуре 4 ° C: в этом примере мы используем крысе анти-CD31 мыши (1:100) для обозначения эндотелия и антимышиного PDGFR-β (1:100) для обозначения периваскулярных клеток. Это полезно для покрытия слайдов с индивидуально нарезанные длинные парафильмом для того, чтобы антитела, равномерно распределены по разделу.
8. После инкубации с первичными антителами, мыть разделах 3 раза в холодной TBS. Инкубируйте 100 мкл соответствующих вторичными антителами в течение 30 минут минимум.
9. Промыть 3 раза в холодной TBS. Добавить 100 мкл монтаж средств массовой информации к каждому слайду и покровного стекла.
10. Разрешить слайды сушить в темном месте хранения.
11. Переходите к разделу 'Image Acquisition.

4. Многоцветный маркировки тимуса сосуды и периваскулярные клетки для vibratome разделах (Continue из раздела 1, шаг 7)

1. Рассеките из тимуса долях от эмбриона и промыть в холодной PBS.
2. Fix вилочковой железы в 4% PFA / PBS при комнатной температуре в течение 2 часов.
3. Стирать в PBS-Triton X (0,15%) 3 раза, 10 минут и место thymi в небольшой пластиковый картридж и погрузить в 4% агарозном низкой расплава / PBS (~ 4 ° С). Вилочковой железы должно быть в контакте с нижней части картриджа.
4. Разрешить агарозном закрепить на льду (3-5 минут). Используйте лезвие, чтобы отрезать избыточного агарозы. Добавить клей vibratome блоков и придерживаться образца блока.
5. Добавить холодным ФСБ в водяной бане, пока vibratome образца и лезвия погружаются.
6. Установить скорость и амплитуду (большой амплитудой и низкой средней скоростью идеально подходит для мягкой тимуса разделы). Амплитуда должна быть уменьшена, если разделы разбить из-за лишнего волнения.
7. Вырезать 50 мкм разделов.
8. Использование кисти, собирать секции в 24-ю лунками в холодном PBS.
9. Блок секций в 500 мкл 10% осла сыворотки в PBS-Triton X (0,15%) в течение 30 минут.
10. Инкубируйте разделы в течение 8 часов в ночь с первичным антителом, таких как анти-CD31 и анти-PDGFR-β, В закрытой 24-ю лунками.
11. Промыть 3 раза PBS-Triton X (0,15%) по сравнению с всего 8 часов при температуре 4 ° C.
12. Блок секций в 10% осла сыворотки в PBS-Triton X (0,15%) в течение 30 минут.
13. Инкубируйте разделы в течение 8 часов в течение ночи при 4 ° С с соответствующими вторичными антителами.
14. Промыть 3 раза PBS-Triton X (0,15%) по сравнению с всего 8 часов при температуре 4 ° C.
15. Повторное исправление образцов в 4% PFA / PBS в течение 30 минут на льду.
16. Промыть 3 раза PBS-Triton X (0,15%) в течение 30 минут на льду.
17. Дегидрировать образцы через градуированные MeOH / ПБС-Тритон Х серии: 25% метанола, 50% метанола, 75% метанола и 100% метанола на 10 минут для каждого шага. Замените 100% метанола со свежим метанолом через 10 минут и выдержать в течение 1 часа при комнатной температуре.
18. В стеклянном контейнере, смешайте Babb (бензиловый спирт: бензил бензоат) в соотношении 1:2. Комбинат Babb с метанолом для конечной концентрации 50% Babb и 50% метанола. Инкубируйте образца в Babb: MeOH в течение 10-15 минут.
19. Передача образца стеклянный контейнер с 100% Babb и инкубировать в течение 10-15 минут или пока не рассеялся, при комнатной температуре.
20. Заполните депрессии слайд (0,7 мм глубины) со свежим 100% Babb и передачи образцов в сторону. Добавить покровного стекла (№ 1,5) и печать с 2-3 слоя лака для ногтей. Разрешить лак для ногтей, чтобы укрепиться в темноте при комнатной температуре, затем хранить образцы при температуре 4 ° C.
    Примечание: Слайды должны быть полностью запечатаны до конфокальной захвата изображений. Изображения должны быть приобретены в течение 12-24 часов, а флуоресцентные красители могут исчезать в Babb.
21. Переходите к разделу 'Image Acquisition.

5. Image Acquisition

1. Изображение 10 мкм замороженных срезов с использованием конфокальной микроскопии План-Apochromat 20X/0.8 цель (512 х 512 пикселей) с 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B _4), 543 - и 633-нм линий лазера.
2. Приобретать конфокальной г-сечения всей кожей монтировать и 50 мкм агарозном-срезы использования План-Apochromat 10X/0.4 цель (512 х 512 пикселей) с 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B _4), 543 -, и 633-нм линий. Последовательный Z-разделы должны быть собраны последовательно на 1-микронных для каждого соответствующего канала.
3. Реконструкция серийный Z-разделы, используя Zeiss AxioVision 4.6 или другого программного обеспечения для анализа изображений.

6. Представитель Результаты:

Эффективная маркировка эмбриональных сосудистой имеет решающее значение для оценки дефектов кровеносных сосудов в эмбриональный мышей. На рисунке 1 показаны конкретные маркировки E16.5 тимуса кровеносных сосудов (1А-Б) и со-маркировки с CD31 (1B), в дополнение к окрашивание правого и левого желудочков (1E-F), соответственно. GSL I-isolectin B ₄ протокола для cryosections, как описано в разделах 1, 3 и 5 был использован в этих экспериментах. Всего монтажа маркировка судна кожи кровью сети на E16.5 мышей, с использованием протоколов, описанных в разделах 1, 2 и 5 показан на рисунке 1С-D.

Рисунок 1 Legend. FITC GSL Я - isolectin B ₄ лица инъекции вены в E16.5 эмбрионов мыши. a. Cryosection эмбрионального тимуса после инъекции. b. Слияние CD31 совместно маркировки с isolectin В _4. c. и d. Всего монтажа эмбриональной кожи сосудистую после инъекции. e. и f. Cryosection эмбрионального сердца e. (справа желудочка) f. (левый желудочек) после инъекции.

Обсуждение

Всего монтажа и PECAM-1 (CD31) пятен на разделы обычных методов маркировки сосудистую в эмбриональных мышей. Эти методы требуют использования прямых и / или непрямой иммунофлюоресценции, а также моющие средства permeabilize мыши ткани. Это оказывается весьма своевременным процесса. Здесь мы испол...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
FITC-декстрана	Сигма	FD150S-1G
Fluorescein помечены GSL 1 - isolectin B 4	Vector Laboratories	FL-1201
Быстрый зеленый	MP Biomedicals	195178
PFA	Fluka	76240
Эмбриональной бычьей сыворотки	Атланты биологические препараты	S11550
Оптимальная температура резки соединения (ОКТ	VWR	25608-930
Ацетон	JT Baker	9006-33
Осел сыворотки	Джексон	017-000-121
Крыса анти-CD31 мыши,	BD Pharmingen	558736
антимышиного PDGFR-β	R & D Systems	AF1042
осле анти-CD31 крысы Alexa 647 (Invitrogen)	Biolegend	102516
осле анти-козел Alexa 594 (Invitrogen)	Invitrogen	A11058
Тритон Х -100	Sigma-Aldrich	X-100
Низкий расплава агарозы / PBS	Sigma-Aldrich	A9414-25G
Метанол	Fisher Scientific	A413-4
Бензиловый спирт	Acros Научные	148390010
Бензил бензоат	Acros Научные	105860010
Депрессия слайды	Fisher Scientific	S175201
Fluorogel	Электронная микроскопия наук	17985-10
Крышка стекла (22x22) -1,5	Thermo Scientific	152222
Zeiss LSM 510 Мета конфокальной микроскопии	Zeiss
Micro рассекает щипцы	Roboz	RS-5135
Парафильмом Количество OM992	Fisher Scientific	13-374-16
12 и 24 и планшеты	Evergreen Научные	222-8044-01F
SuperFrost / Plus Слайды микроскоп	Fisher Scientific	12-550-15
4 мл ясно флаконах	Национальный научный	B7800-2