阿的Cre - LOX P为检测细胞融合重组方法在体内</em

摘要

一个在生活随着时间的推移的生物体细胞融合的方法来跟踪描述。该方法利用CRE - LoxP位重组荧光素酶表达诱导细胞融合后。产生荧光信号可以检测到使用生物光子成像系统的检测〜1000细胞周围组织的敏感性，在生活的有机体。

摘要

已使用两个或两个以上的相同类型的细胞融合的能力，在整个进化的后生动物，形成了许多复杂的器官，包括骨骼肌肉，骨骼和胎盘。现代研究表明，同一类型的细胞融合赋予了增强的功能。例如，当胎盘保险丝的滋养层细胞形成的合体，合体能够更好地运输营养和激素跨^比 1-4非稠合滋养的母胎屏障。最近的研究表明，不同类型的细胞融合可以直接细胞的命运。曾经被认为“回归”或修改融合细胞的命运是有限的细胞培养系统。但干细胞移植的到来我们发现，干细胞可以在体内与体细胞融合，融合促进干细胞^分化 5-7 。因此，细胞融合是一个监管过程中Capable促进细胞的存活和分化，从而可以发展，修复组织和疾病的发病机制的极端重要性。

限制细胞融合的研究，是缺乏适当的技术：1）准确地识别融合的产品，以及2）随着时间的推移跟踪融合产品。这里我们提出一种新的方法来解决双方的局限性，通过融合后诱导生物发光（图1）;可生物发光检测灵敏度高，在 ^体内 8-15，我们利用一个构造编码萤火虫荧光素酶基因（Photinus pyralis）放在相邻一个终止密码子两侧LoxP位序列的细胞与细胞表达Cre重组酶蛋白基因的保险丝时，LoxP位网站裂解，使荧光素酶转录停止信号切除，由于信号是induciBLE，假阳性信号的发病率是很低的。与现有方法利用CRE / LoxP系统^16，17不同的是，我们已成立了一个“活”的探测信号，从而承受的首次机会跟踪体内细胞融合的动力学。

为了证明这种方法，无处不在表达Cre重组酶的小鼠干细胞转染与构造来表达一个floxed终止密码子的荧光素酶的下游接受者。干细胞移植通过内注射和移植活体图像分析后进行跟踪存在随着时间的推移的心脏和周围组织的融合产品。这种方法可以适应在任何组织类型分析，在任何阶段的发展，疾病或成人组织修复细胞融合。

研究方案

1。捐赠者细胞转染

1. 丰年间质干细胞（MSCs的，从H1胚胎干细胞Peiman Hematti博士惠赠捐赠所得;或者任何假设保险丝在体内的任何物种的细胞类型可受聘）在70 - 80％与1X胰蛋白酶合流（Mediatech 马纳萨斯VA 5分钟）。失活胰蛋白酶，α- MEM完全培养基（无抗生素，Invitrogen公司，卡尔斯巴德^CA）18 。在300 XG离心5分钟。
2. 小心吸上清和重新暂停颗粒在1毫升的1X PBS和使用hemacytometer计数细胞。
3. 转让1.5 × 10 ⁶细胞1.5 mL离心管中。在300 XG离心5分钟。
4. 小心吸上清液。悬浮颗粒在300μLR缓冲（霓虹灯转染系统，Invitrogen公司）和6微克（2微克/ 5.0 × 10 ^5个细胞）的P231 pCMVe betaAc一站式LUC（Addgene，剑桥，麻省）。将3毫升的E缓冲器（Invitrogen）电击到每个制造商的协议的对接端口（霓虹灯转染系统，Invitrogen公司）。
5. 转移细胞质粒的解决方案，以100μL霓虹灯吸管尖和electroporate与脉冲持续时间为20毫秒和1500伏级。广场电穿孔细胞成15 mL锥形管含有9.7 mL的α- MEM完全培养基。
6. 重复步骤1.5两个额外的时间和池转染细胞产生一个10毫升的总量。一个T175的α- MEM完全培养基含10 mL的容量瓶中加入10 mL细胞悬液（1.5 ^× 10 6细胞）。细胞的生存能力电击后约30％，产量约4.5 × 10 ^5％T175活菌。
7. 更改α- MEM完全培养基24小时后转。
8. 收获转染细胞时70 - 80％的融合（1〜2 - 3天之后，电击）。执行使用hemacytometer细胞计数，重悬细胞浓度为1.0 × 10 ⁶cells/50μL的α- MEM完全培养基。花最少的时间细胞悬浮液中，在注射之前，以减少细胞死亡。

2。内注射

1. 麻醉诱导异氟醚（凤凰制药公司，圣若瑟，密苏里州）工程组成的每一个细胞中的表达 Cre重组酶（B6.C - TG（CMV - CRE）1Cgn / J杰克逊实验室，巴尔港的转基因小鼠， ME）。
2. 从胸前地区取下的头发使用卷发器或化学头发卸妆。
3. 插管与18号导管（碧迪公司，新泽西州富兰克林湖）和地方对小鼠呼吸机在120 - 每分钟130次与搏出量为150μL。
4. 整个第四肋间空间，从而产生一个开胸外侧切口。
5. 可视化心脏，使转染细胞悬液25μL，用1 mL注射器（Temuro医药公司，萨默塞特，新泽西州）和28号针头（Bect的注射迪金森与合作，新泽西州富兰克林湖）。为了缓解内注射，防止过度损害的器官，弯曲的针头〜90度。
6. 注射后，使用可吸收缝合线（例如，薇乔）接近肋骨和肌肉层。缝合皮肤封闭，用4-0尼龙或丝​​绸。
7. 允许鼠标恢复从麻醉拔管。
8. 对照组应包括的Cre小鼠接受中等注射只，CRE小鼠接受未转染细胞和转染细胞（另外，CRE小鼠接受不容易转染细胞融合）的野生型小鼠接受同样的浓度 。

3。生物光子成像

1. 五到十五分钟前，腹腔成像（IP）的注入10μL每克的小鼠体重15毫克/毫升的D -荧光素（卡尺生命科学，霍普金顿，马）。
2. 诱导小鼠通过异氟醚麻醉诱导一个4％D 1 - 2％进行维修。
3. 广场小鼠仰卧在成像盒口罩管理1 - 2％异氟醚维护麻醉（精诺真生物光子成像系统，霍普金顿，马）。几个老鼠可同时成像。图像深水实验小鼠为便于比较，荧光信号的控制鼠标。
4. 使用生活图像软件（精诺真），设置适当的曝光时间（通常为60秒，看到的结果）。设置面积的图像，以适应老鼠，并保持整个成像区保持一致，以防止敏感性的变化。设置受到高度在4.5厘米。
5. 视野内取得相应的鼠标或鼠标的发光强度信号，并保存未修改图像文件。处理图像去除背景信号，相应的控制或unmanipulated鼠标。上述背景下的强度值对应内的动物细胞融合。生活图像软件（精诺真）或开源的图像分析软件，可进行强度分析。 Typically，一个感兴趣区域（ROI）是选择比较动物和实验之间的强度数据。

4。代表性的成果

要确定精诺真生物光子成像系统的灵敏度，组成表达荧光素酶（LUC - 231 - D3H1，精诺真）被送到C57/Bl6小鼠（杰克逊实验室）心肌细胞系的细胞注射浓度为 1 × 10 ^6，1 × 10 ^3，或1 × 10 ¹细胞细胞交付六个小时后，老鼠被注射用荧光素腹腔和使用的精诺真系统成像。 1000细胞（2 6小鼠成像， 图2）可以检测到一个特定的信号，但检测与万细胞（6小鼠成像6）更可靠。更重要的是，这项研究还有助于建立一个荧光素酶的表达和信号强度之间的粗糙的相关性。

为了演示描述协议，在检测和跟踪细胞融合的效用，MSCS转LoxP位停止LoxP位的萤光素酶的质粒（Addgene） 和交付表达 Cre重组酶的小鼠心肌。大约一周后细胞交付，小鼠首次使用无精诺真系统的D -荧光素注射成像。正如预期的那样，没有酶底物，，没有强度信号检测（图 3 ）。接下来，D -荧光素腹腔注射和相应的信号强度，以荧光素酶，从而在两个，四个测试小鼠检测细胞融合。类似的信号检测到一个星期后（ 图3），提示MSC耦合 ​​融合产品，可在体内维持在这种情况下，这项研究被终止，以便评估心脏及周围组织，而是一个可以预见的较长期的分析和更频繁的成像跟踪维护，扩散ð也许迁移融合的产品，在小鼠体内。

图1。 检测体内细胞融合技术的原理，如果融合之间的Cre表达小鼠细胞和移植的细胞表达一个floxed荧光素酶质粒发生，荧光素酶将表示。可检测到荧光素酶注射到老鼠的D -荧光素酶的底物，然后成像鼠标使用精诺真生物光子成像系统（改编来自19个）

图2。检测的灵敏度荧光素酶表达在心肌组织细胞与生物光子成像。细胞系组成表达荧光素酶（LUC - 231 - D3H1，精诺真）被送到C57/Bl6在不同的总细胞数的小鼠心肌内空间。重新小鼠的代表图像ceiving 1 × 10 ^6，1 × 10 ³和1 × 10 ¹细胞（左到右）所示，成像进行了注射后约6小时。

图3。 在体内的发光细胞融合的指标量化 。MSCs的转染的LoxP位停止LoxP位荧光素酶质粒和交付表达Cre重组酶的小鼠心肌。大约一个星期，两个星期后，细胞传递，CRE小鼠成像利用精诺真生物光子成像系统，测量表明细胞融合的发光强度。 （一）覆盖的照片和1-4深水和小鼠的发光强度（左到右）17日天后细胞交付。 （二）1-4深水和小鼠的发光强度（左到右）细胞交付后的17天。一个选择感兴趣的区域（黄色）相应的注射部位和强度升使用ImageJ（免费源）软件²⁰ evels。 （三）发光强度是归所有的实验条件下相同的地区深水鼠标的兴趣。在一个星期后，老鼠3和第4条呈阳性的发光信号，表明了小鼠细胞和移植的MSC的自发融合。坚持3鼠标在两个星期的信号。要确定特定器官本地化的信号对应鼠标3，胸腔暴露的主要器官切除和成像。 （四）覆盖的照片和鼠标3的发光强度。注意本地化在小肠的信号强度。 （五）3鼠标发光强度。 （六）覆盖照片和假鼠标的发光强度。 （G）的假鼠标的发光强度。

讨论

这里的方法允许的话，第一次，在生物识别离散细胞融合和时空分析，包括小动物。后续的生物光子图像分析的方法相结合的Cre - LoxP位重组。跟踪不仅是细胞与细胞融合的方法是适合，而且病毒的细胞融合等可以跟踪病毒感染的证明。图像分析是快速，有可能图像的多个小动物的同时，融合检测融合在其相应的微环境，特定的细胞伙伴的频率和LoxP位停止LoxP位的萤光素酶质粒转染效?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
霓虹灯转染系统	Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA	MPK5000
霓虹灯100μL，包	Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA	MPK10025	包含R和发送缓冲区
A - MEM粉末	Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA	12000-022
胎牛血清（FBS）	Hyclone公司，UT斯达康洛根	SH30070.03
B6.C - TG（CMV - CRE）1Cgn / J	巴尔港杰克逊实验室，ME	006054
胰蛋白酶10X	费希尔科学，森林草坪，NJ	MT - 25 - 054 - CL
L -谷氨酰胺	费希尔科学，森林草坪，NJ	25030-081
D -荧光素	卡尺生命科学，霍普金顿，马	122796
精诺真生物光子成像系统	卡尺生命科学，霍普金顿，马	IVIS频谱
钠Biocarbonate	西格玛Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州	S6014 - 500G
非必需氨基酸	Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA	11140-050