세포 융합의 탐지를위한 Cre - 훈제 연어 P 재조합 접근법 VIVO에서</em

요약

시간이 지남에 따라 생물을 생활에 세포 융합을 추적하는 방법을 설명합니다. 접근 이용 Cre -를 LoxP 재조합은 세포 융합에 루시페라제 표현을 유도합니다. 생성되는 발광 신호는 주변 조직의 ~ 1,000 세포의 검출의 감도와 biophotonic 이미징 시스템을 사용하여 살아있는 생물에서 발견하실 수 있습니다.

초록

퓨즈에 같은 종류의 두 개 이상의 세포의 기능은 골격근, 뼈 및 태반 등 많은 복잡한 장기를 형성하기 위해 진화를 통해 metazoans에서 널리 사용되었습니다. 현대 연구는 같은 종류의 세포 융합 향상된 기능을 수여 보여줍니다. 예를 들어, 태반 퓨즈의 trophoblast 세포가 syncytiotrophoblast을 형성하면 syncytiotrophoblast 더 unfused trophoblasts ^1-4보다 모성 - 태아 장벽에 걸쳐 영양소와 호르몬을 수송 수 있습니다. 최근 연구는 다른 종류의 세포 융합 세포의 운명을 직접 보여준다. 융합에 의한 "복귀"또는 세포 운명의 수정은 한 번 세포 배양 시스템에 국한 것으로 생각되었다. 그러나 줄기 세포 이식의 출현은 우리에 의해 발견 LED와 줄기 세포를 다른 생체내의 체세포와 퓨즈 수 있으며 그 융합은 줄기 세포 분화가 ^5-7 용이하게합니다. 따라서, 세포 융합은 규제 프로세스는 C따라서 세포 생존과 분화를 촉진의 apable 및 개발, 조직의 수리도 질병의 pathogenesis에 대한 중앙의 중요성 수 있습니다.

적절한 기술의 부족)가 1, 세포 융합의 연구는 제한하는 것은 정확하게 시간이 지남에 따라) 트랙 융합 제품을 융합 제품을 식별하고 2. 여기에 우리가 퓨전시 bioluminescence의 유도 (그림 1)를 통해 모두 한계를 해결하기 위해 새로운 접근 방식을 제시,. bioluminescence는 생체내 ^8-15 높은 감도로 감지할 수 있습니다 우리는 반딧불 루시페라제 인코딩 구조를 활용 (Photinus pyralis) 유전자에 인접한 위치 정지 코돈은 LoxP 시퀀스의 어귀. Cre recombinase 단백질을 표현하는 세포이 유전자 퓨즈를 표현 세포, LoxP 사이트가 죽습하고 정지 신호 루시페라제의 전송을 허용 excised하는 것입니다. 신호가 induci이기 때문에경, 거짓 - 긍정적인 신호의 발병률은 매우 낮은 것입니다. Cre / LoxP 시스템 ^{16, 17를} 사용하는 기존의 방법과는 달리, 우리는 "살아있는"감지 신호를 통합하고이를 처음 생체내의 세포 융합의 속도론을 추적할 수있는 기회를 감당할.

접근 방식을 보여주기 위해, ubiquitously Cre recombinase을 표현 쥐가 floxed 중지 코돈의 루시페라제 스트림을 표현하는 구조로 transfected 줄기 세포의 수신자을 역임했습니다. 줄기 세포는 intramyocardial 주입을 통해 이식되었으며 이식 intravital 이미지 분석의 존재를 추적하기 위해 실시 후 시간이지나면서 심장과 주변 조직의 융합 제품. 이러한 접근 방식은 개발, 질병 또는 성인 조직 복구의 모든 단계에서 모든 조직 유형의 세포 융합을 분석 적응 수 있습니다.

프로토콜

1. 공여 세포 Transfection

1. 수확 mesenchymal 줄기 세포 (친절하게 박사 Peiman Hematti 기증한 H1 배아의 줄기 세포에서 파생된 MSCS; 또는 생체내의 퓨즈로 가상 어떤 종류의 셀 타입은 고용 수) 70 - 1X 트립신과 합류 80 % (Mediatech, 5 분 매나 사스 VA는.) α - 가상 완료 매체 (항생제 무료, Invitrogen, Carlsbad CA) ¹⁸ 트립신을 Inactivate. 5 분 300 XG에 원심 분리기.
2. 조심스럽게 뜨는 대기음하고 다시 중지 펠렛 1X PBS 1 ML에서 hemacytometer를 사용하여 셀을 계산합니다.
3. 1.5 ML의 원심 관에 전송 1.5 X 10 ⁶ 세포. 5 분 300 XG에 원심 분리기.
4. 조심스럽게 뜨는 기음. R 버퍼 (네온 Transfection 시스템, Invitrogen)와 6 μg (2 μg / 5.0 × 10 ⁵ 세포) 300 μL에 Resuspend 펠렛 p231 pCMVe - betaAc - STOP 룩 (Addgene, 캠브리지, MA). E 버퍼의 장소 3 ML (Invitr제조 업체의 절차에 따라 electroporation 도킹 포트 (네온 Transfection 시스템, Invitrogen)에 ogen).
5. 100 μL 네온 pipet 팁에 휴대 플라스미드 솔루션을 전송 20 MS와 1,500 볼트의 크기의 펄스 기간과 electroporate. 장소는 9.7 ML α - 전체 가상 매체를 포함 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 electroporated.
6. 10 ML의 총 볼륨을 얻을 1.5 두 가지 추가 시간 및 수영장 transfected 세포 단계를 반복합니다. 10 ML α - 전체 가상 매체를 포함하는 T175 플라스크에 10 ML의 세포 현탁액을 (1.5 X 10 ⁶ 셀) 추가합니다. electroporation 후 세포 생존 능력은 T175 약 4.5 × 10 ⁵ 가능한 세포를 양보하기 위해, 약 30 %입니다.
7. 변경 transfection 다음 중간 24시간 α - 가상 완료되었습니다.
8. 80 % 합류 (~ 2 - - 삼일 electroporation 후) 수확 70 세포를 transfected. hemacytometer를 사용하여 셀 카운트를 수행하고 1.0 × 10 ⁶ 농도에서 세포를 resuspendα - 가상 완료 매체의 cells/50 μL. 최소화 시간 세포 주입하기 전에 세포 사망을 줄이기 위해 서스펜션에 보냅니다.

2. Intramyocardial 사출

1. 모든 셀에 constitutively 표현 Cre recombinase (B6.C - TG (CMV - cre) 1Cgn / J, 잭슨 연구소, 바 하버 수 있도록 설계 유전자 변형 생쥐에 (피닉스 제약 주식 회사, 세인트 조셉, MO) isoflurane으로 마취를 유도 ME).
2. 헤어 가위 또는 화학 헤어 리무버를 사용하여 가슴 지역에서 머리를 제거합니다.
3. 150 μL의 뇌졸중 볼륨 분당 130 심호흡 - 120에서 마우스 환풍기에 18 게이지 카테터 (Becton 디킨슨 & CO, 프랭클린 호수 NJ)와 장소 Intubate.
4. 따라서 thoracotomy을 생산 번째 늑간 공간에 걸쳐 가로 절개를합니다.
5. 심장 떠올리, 1 ML 주사기 (Temuro 의료 법인, 서머셋, 뉴저지) 및 28 게이지 바늘 (Bect를 사용하여 transfected 세포 현탁액의 두 25 μL 주사를에 디킨스 & CO, 프랭클린 호수 NJ). intramyocardial 주사를 완화하고 장기에 과도한 손상을 방지하기 위해 바늘 머리 ~ 90도 구​​부.
6. 주사 후, 갈비뼈 근육 레이어를 닫습니다 흡수성 봉합 (예 : vicryl)을 사용합니다. 봉합사의 피부는 4-0 나일론 또는 실크를 사용하여 마감했다.
7. 마취 및 extubate에서 회복하기 위해 마우스를 허용합니다.
8. 제어 그룹은, Cre 마우스가 untransfected 세포와 transfected 세포를 (또는, Cre 마우스는 퓨즈에 쉽게 무너지는 사람이 아니다 transfected 세포를 수신) 수신 야생 타입 마우스의 동일한 농도를받는 중간 주사를 받고 Cre 마우스를 포함해야합니다.

3. Biophotonic 이미징

1. 이미징, intraperitoneally은 (IP) 15 밀리그램 / ML D - Luciferin (캘리퍼스 생명 과학, Hopkinton, MA)의 마우스 체중 g 당 10 μL를 주입 다섯 데 15 분 전.
2. 유도 4 %로 isoflurane을 통해 생쥐에 마취를 유도D 1 - 유지 보수 2 %.
3. 안면이 1 관리와 이미징 상자에 나태한 장소 마우스 - 유지 보수 마취 (Xenogen Biophotonic 이미징 시스템, Hopkinton, MA)에 isoflurane 2퍼센트. 여러 생쥐는 동시에 몇 군데하실 수 있습니다. 발광 신호를 쉽게 비교 실험 쥐 이미지 가짜 제어 마우스.
4. 생활 이미지 소프트웨어 (Xenogen)를 사용하여 적절한 노출 시간 (일반적으로 60 초, 결과를 참고)으로 설정합니다. 쥐를 적합하고 감도의 변화를 방지하기 위해 영상을 통해 지역 일관성 유지하기 이미지의 영역을 설정합니다. 4.5 cm에서 제목 높이를 설정합니다.
5. 보기 필드 내에서 마우스 또는 마우스에 대응하는 발광 강도 신호를 수집하고 수정되지 않은 이미지 파일을 저장합니다. 프로세스 이미지 컨트롤 또는 unmanipulated 마우스에 해당하는 배경 신호를 제거할 수 있습니다. 배경 위의 강도 값은 동물 내에서 융합 세포에 해당합니다. 강도 분석은 생활 이미지 소프트웨어 (Xenogen) 또는 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 진행하실 수 있습니다. 티ypically, 관심 지역은 (ROI) 동물과 실험 사이의 강도 데이터를 비교하기 위해 선택됩니다.

4. 대표 결과

Xenogen Biophotonic 이미징 시스템의 감도, constitutively C57/Bl6 마우스 (잭슨 연구소)의 myocardium에게 전달되었다 (231 룩 - D3H1, Xenogen) 루시페라제 표현하는 세포 라인을 확인하려면 다음과 같이하십시오. 셀은 1 X의 농도에 주입했다 10 ^6, 1 × 10 ^3, 또는 1 X 10 ¹ 세포. 여섯 시간 세포 전달 후, 마우스가 luciferin와 intraperitoneally을 주입하고 Xenogen 시스템을 사용하여 몇 군데 있었다. 구체적인 신호가 1,000 세포 (몇 군데 2 6의 생쥐, 그림 2)로 감지하지만, 검색은 10,000 셀 (6 군데 생쥐 6)와 함께보다 안정되었습니다 수 있습니다. 중요한 것은,이 연구는 또한 루시페라제 - 표현 세포 및 신호 강도의 개수 사이에 거친 상관 관계를 수립 하였다.

세포 융합을 감지하고 추적에 설명된 프로토콜의 유틸리티를 입증하기 위해, MSCS는 (Addgene) LoxP - 그만 - LoxP - 루시페라제 플라스미드로 transfected과 Cre - 표현 생쥐의 myocardium에 전달했다. 셀 배달 후 약 일주일이 생쥐 먼저 D - luciferin 주입없이 Xenogen 시스템을 사용하여 몇 군데 있었다. 으로 효소 기판없이 예상, 더 강도 신호는 (그림 3) 발견되지 않았습니다. 다음, D - luciferin는 intraperitoneally 및 루시페라제 강도에 해당하는 신호를 주입했고 따라서 세포 융합은 테스트를 두 넷의 생쥐에서 발견되었다. 비슷한 신호가이 경우에는 연구가 중심과 주변 조직의 평가 수 있도록 종료되었습니다. MSC - 결합 융합 제품은 생체내 유지 수있는 제안, 나중에 일주 (그림 3) 발견했지만, 하나는 구상 수있는 장기 분석 및 유지 보수, 확산을 추적하기 위해 더 자주 이미징마우스의 융합 제품 개발 아마 마이 그 레이션.

그림 1. VIVO에서 세포 융합을 감지하는 기술의 개략도. 간의 융합이 Cre가 - 표현 마우스 세포 및 발생하는 floxed 루시페라제 플라스미드를 표현 이식 세포를 루시페라제가 표현되는 경우. 루시페라제는 Xenogen Biophotonic 이미징 시스템 (19에서 적응)를 사용하여 마우스를 마우스로 효소 기판, D - luciferin를 주입 후 영상에 의해 감지 수 있습니다

그림 2. 의 감지 감도 루시페라제 - 표현 biophotonic 영상과 심장 조직에서 세포를. constitutively (231 룩 - D3H1, Xenogen) 루시페라제 표현 세포 라인은 다양한 전체 휴대폰 번호에서 C57/Bl6 생쥐의 intramyocardial 공간으로 전달했다. 생쥐의 대표 이미지는 다시1 × 10 ^6, 1 X 10 ³ 1 X 10 ¹ 세포 (오른쪽 왼쪽) ceiving하면 표시됩니다, 이미지는 대략 6 시간 후에 주사를 실시했다.

그림 3. 세포 융합되었음을 암시 VIVO의 발광에의 부량. MSCS는 플라스미드 LoxP - 그만 - LoxP - 루시페라제과 Cre - 표현 생쥐의 myocardium 배달과 transfected되었다. 약 일주일에 2 주 세포 전달 후, Cre 마우스는 세포 융합을 나타내는 발광의 강도를 측정하는 Xenogen Biophotonic 이미징 시스템을 사용하여 몇 군데 있었다. 17일 세포 전달 후 사기와 생쥐 1-4 발광의 사진과 강도의 (A) 중첩 (오른쪽 왼쪽). (B) 사기와 생쥐 1-4 발광의 강도 (오른쪽 왼쪽) 휴대폰 전송 후 17일. 관심 지역은 사출 사이트 및 강도 리터에 해당하는 (노란색)을 선택했습니다evels는 ImageJ (무료 소스) 소프트웨어를 사용하여 ^20으로 결정됩니다. (C) 발광의 강도는 모든 실험 조건에 대한 사기 마우스의 관심 동일한 지역에 정상화되었다. 일주에서 마우스 3과 4는 마우스 세포와 이식 MSC의 자발적인 융합을 제안 긍정적인 발광 신호를 보여주었다. 신호는 2 주에서 마우스를 지속 3. 마우스 3에 해당하는 신호의 기관 고유의 로컬 리 제이션을 확인하려면, 흉강는 노출 및 기본 기관 excised하고 몇 군데했습니다. 사진 및 마우스 3 발광의 강도 (D) 중첩. 소장의 강도 신호의 참고 지방화. 마우스 3 발광의 (E) 강도. 사진과 가짜 마우스 발광의 강도 (F) 중첩. 가짜 마우스의 발광의 (G) 강도.

토론

방법은 작은 동물을 포함하여 생물에서 처음으로, 수 여기에 세포 융합의 개별 식별 및 시간적 분석을 설명했다. 접근 방식은 이후 biophotonic 이미지 분석 Cre - LoxP 재조합을 결합한 제품입니다. 접근 방식은 세포 - 세포 융합뿐만 아니라 추적 의무가있다,뿐만 아니라 바이러스 세포 융합 등 바이러스 감염을 추적하기위한 유용 수 있습니다. 이미지 분석은 신속하고 그것은 동시에 이미지를 여러 작?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
네온 Transfection 시스템	Invitrogen, Carlsbad, CA	MPK5000
네온 100 μL 키트	Invitrogen, Carlsbad, CA	MPK10025	R과 E 버퍼를 포함
- 가상 분말	Invitrogen, Carlsbad, CA	12000-022
태아 소 혈청 (FBS)	Hyclone, 로건 UT	SH30070.03
B6.C - TG (CMV - cre) 1Cgn / J	잭슨 연구소, 바 하버, ME	006,054
10X 트립신	피셔 과학, 숲 잔디, 뉴저지	MT - 25-054 - CL
L - 글루타민	피셔 과학, 숲 잔디, 뉴저지	25030-081
D - Luciferin	캘리퍼스 생명 과학, Hopkinton, MA	122,796
Xenogen Biophotonic 이미징 시스템	캘리퍼스 생명 과학, Hopkinton, MA	IVIS 스펙트럼
나트륨 Biocarbonate	시그마 알드리치, 세인트 루이스, 미주리	S6014 - 500G
비 필수 아미노산	Invitrogen, Carlsbad, CA	11140-050