Cre-P לקס גישה רקומבינציה לצורך זיהוי של Fusion Cell In vivo</em

Summary

שיטה כדי לעקוב אחר איחוי תא אורגניזמים חיים על פני זמן מתואר. הגישה מנצל Cre- LoxP לגרום הביטוי בלוציפראז על איחוי תאים. האות זורח שנוצר ניתן להבחין יצורים חיים באמצעות מערכות הדמיה biophotonic עם רגישות של גילוי של ~ 1,000 תאים ברקמות היקפי.

Abstract

היכולת של שני תאים או יותר מאותו סוג הפתיל נוצל metazoans במהלך האבולוציה כדי ליצור איברים מורכבים רבים, כולל שרירים ועצמות השלד, ואת השליה. מחקרים עכשוויים מראים היתוך של תאים מאותו סוג מעניקה פונקציה משופרת. למשל, כאשר תאים trophoblast של הפתיל את השליה לטופס syncytiotrophoblast, syncytiotrophoblast הוא טוב מסוגל להעביר חומרים מזינים והורמונים דרך מחסום אימהית, העובר מאשר trophoblasts unfused ^1-4. מחקרים מאוחרים יותר מראים היתוך של תאים מסוגים שונים יכול לכוון גורל התא. "חזרה" או שינוי גורל התא על ידי היתוך חשבו פעם להיות מוגבל במערכות תרבית תאים. אבל הופעתו של השתלת תא גזע הובילו לגילוי על ידינו ואחרים בתאי גזע יכול להתמזג עם תאים סומטיים in vivo ו היתוך המאפשר בידול תא גזע ^5-7. לפיכך, המיזוג התא תהליך מוסדר גapable לקידום הישרדות התא בידול ולכן יכול להיות בעל חשיבות מרכזית לתיקון הפיתוח של רקמות ואפילו בפתוגנזה של המחלה.

הגבלת המחקר של היתוך התא, הוא היעדר טכנולוגיה מתאימה 1) לזהות במדויק מוצרים היתוך ו 2) היתוך מוצרים לעקוב לאורך זמן. כאן אנו מציגים גישה חדשנית לטיפול הן המגבלות באמצעות אינדוקציה של פליטת אור על היתוך (איור 1):. פליטת אור ניתן לאתר עם ​​רגישות גבוהה in vivo ^8-15 אנו מנצלים לבנות קידוד בלוציפראז גחלילית (Photinus pyralis) הגן ממוקם בסמוך קודון להפסיק מוקף רצפים LoxP. כאשר תאים להביע את הפתיל גן עם תאים המבטאים את חלבון recombinase Cre, אתרי LoxP הם ביקע את האות לעצור הוא נכרת ומאפשר שעתוק של בלוציפראז. בגלל האות inducible, שכיחות חיוביות שגויות אותות נמוך מאוד. בניגוד לשיטות הקיימות אשר מנצלים את Cre / מערכת LoxP ^{16, 17,} יש לנו שולבו "חי" אות זיהוי ובכך להרשות בפעם הראשונה את ההזדמנות כדי לעקוב אחר קינטיקה של איחוי תאים in vivo.

כדי להדגים את הגישה, עכברים בכל מקום בגוף להביע Cre recombinase שימש מקבלי בתאי גזע transfected עם לבנות להביע את הזרם בלוציפראז של קודון עצירה floxed. בתאי גזע הושתלו באמצעות הזרקה intramyocardial ואחרי ניתוח השתלת intravital תמונה נערך כדי לעקוב אחר נוכחות היתוך מוצרים הלב הרקמות הסובבות לאורך זמן. גישה זו יכולה להיות מותאם לנתח איחוי תאים בכל סוג רקמה בכל שלב של המחלה ופיתוח, או לתקן רקמות מבוגר.

Protocol

1. תא התורם transfection

1. Mesenchymal קציר בתאי גזע (MSCs, שמקורם בתאי גזע עובריים H1 נתרם באדיבות על ידי ד"ר Peiman Hematti; לחילופין, כל סוג תא של כל מיני שיערו הפתיל in vivo יכול להיות מועסק), כאשר 70-80% ומחוברות עם 1X טריפסין (Mediatech, Manassas VA) במשך 5 דקות. להשבית טריפסין עם המדיום α-ממ מלא (ללא אנטיביוטיקה, Invitrogen, Carlsbad CA) ^18. צנטריפוגה ב XG 300 דקות 5.
2. בזהירות לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל של 1X PBS ו לספור תאים באמצעות hemacytometer.
3. העברת 1.5 x 10 ⁶ תאים צינור 1.5 צנטריפוגות מ"ל. צנטריפוגה ב XG 300 דקות 5.
4. בזהירות לשאוב supernatant. Resuspend גלולה ב 300 μL של R חוצץ (מערכת נאון transfection, Invitrogen) ו 6 מיקרוגרם (2 מיקרוגרם / 5.0 x 10 ⁵ תאים) של p231 pCMVe-betaAc-STOP לוק (Addgene, Cambridge, MA). מקום 3 מ"ל של הצפת E (Invitrעוגן) ליציאת electroporation עגינה לכל פרוטוקול של היצרן (מערכת transfection נאון, Invitrogen).
5. העברת התא הפלסמיד פתרון טיפ 100 Neon μL pipet ו electroporate עם משך פעימה של 20 אלפיות ו גודל של 1500 וולט. המקום electroporated תאים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל מכיל 9.7 מ"ל α-ממ בינוני מלא.
6. חזור על שלב 1.5 פעמיים נוספות ותאי בריכה transfected להניב בנפח כולל של 10 מ"ל. מוסיפים 10 מ"ל תא ההשעיה (1.5 x 10 ⁶ תאים) כדי T175 בקבוק המכיל 10 מ"ל α-ממ בינוני מלא. כדאיות התא לאחר electroporation הוא כ 30%, תשואה של כ 4.5 x 10 ⁵ תאים לכל קיימא T175.
7. שנה α-ממ להשלים בינוני 24 שעות לאחר transfection.
8. קציר transfected תאים כאשר 70-80 ומחוברות% (~ 2 - 3 ימים לאחר electroporation). בצעו ספירת תאים באמצעות hemacytometer ו resuspend התאים בריכוז של 1.0 x 10 ⁶cells/50 μL של המדיום α-ממ להשלים. מזעור התאים זמן לבלות ההשעיה כדי להפחית מוות של תאים לפני ההזרקה.

2. Intramyocardial Injection

1. להשרות הרדמה על ידי isoflurane (פיניקס Pharmaceuticals, Inc, סנט ג'וזף, מיזורי) על העכברים הטרנסגניים מהונדסים constitutively להביע Cre recombinase בכל תא (B6.C-Tg (CMV-cre) 1Cgn / J, ג'קסון מעבדה, בר הרבור, ME).
2. הסרת שיער מאזור החזה באמצעות קוצץ שיער או שיער מסיר כימי.
3. לצנרר עם קטטר 18 מד (בקטון דיקינסון ושות', פרנקלין לייקס NJ) ומקום למכונת הנשמה העכבר 120-130 נשימות לדקה עם נפח של שבץ μL 150.
4. בצע חתך לרוחב פני השטח צלעי fourth ובכך לייצר פתיחת בית החזה.
5. לדמיין את הלב, לעשות שני 25 זריקות μL ההשעיה תא transfected באמצעות מזרק 1 מ"ל (Temuro רפואי Corporation, Somerset, NJ) ו - 28 מחט מד (Bectעל דיקינסון ושות', פרנקלין לייקס NJ). כדי להקל על הזרקת intramyocardial ולמנוע נזק מוגזם האיבר, לכופף את ראש מחט ~ 90 מעלות.
6. בעקבות הזריקה, להשתמש בתפרים נספגים (למשל, vicryl) כדי לסגור את הצלעות שכבות השריר. עור תפר סגור באמצעות ניילון משי או 4-0.
7. אפשר העכבר כדי להתאושש הרדמה extubate.
8. קבוצות הבקרה צריכה לכלול עכברים Cre קבלת זריקות בינוני בלבד, עכברים Cre לקבל את אותו ריכוז של תאים untransfected ועכברים סוג בר קבלת תאים transfected (לחלופין, עכברים Cre קבלת תאים transfected לא נוטה הפתיל).

3. Biophotonic הדמיה

1. חמש עד חמש עשרה דקות לפני הדמיה, intraperitoneally (IP) להזריק 10 μL לגרם משקל גוף העכבר של 15 מ"ג / מ"ל ​​D-Luciferin (Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA).
2. להשרות הרדמה על עכברים באמצעות isoflurane ב 4% לזירוזד 1-2% לצורך תחזוקה.
3. מקום עכברים פרקדן בתיבת הדמיה עם facemask מתן 1-2% isoflurane עבור הרדמה תחזוקה (מערכת הדמיה Xenogen Biophotonic, Hopkinton, MA). מספר העכברים ניתן הדמיה במקביל. תמונה דמה עכבר שליטה עם עכברי הניסוי לצורך השוואה קלה של האות זורח.
4. באמצעות תמונה Living תוכנה (Xenogen), לקבוע זמן החשיפה המתאימה (בדרך כלל 60 שניות, לראות תוצאות). הגדרת שטח של התמונה כך שתתאים עכברים לשמור אזור עקביות לאורך הדמיה כדי למנוע שינויים ברגישות. קביעת גובה הנושא 4.5 ס"מ.
5. רוכשת את עוצמת הארה האות המתאים העכבר או עכברים בתחום להציג ולשמור קבצי תמונה ללא שינוי. תמונות תהליך להסיר אות הרקע המתאים כדי לשלוט או עכבר unmanipulated. ערכים עוצמה מעל רקע מתאימות התאים התמזגו בתוך החיה. ניתוח עוצמת ניתן לבצע באמצעות תמונה Living תוכנה (Xenogen) או קוד פתוח תוכנה לניתוח תמונה. T ypically, באזור של עניין (ROI) נבחרה כדי להשוות נתונים בין עוצמת ניסויים בבעלי חיים.

4. נציג תוצאות

כדי לקבוע את הרגישות של מערכת הדמיה Biophotonic Xenogen, קו תאים אשר constitutively מבטא בלוציפראז (231-Luc-D3H1, Xenogen) נמסר שריר הלב של C57/Bl6 עכברים (ג'קסון מעבדה). הוזרקו תאים בריכוזים של 1 x 10 ^6, 1 x 10 ^3, או 1 ¹ x 10 תאים. שש שעות לאחר הלידה התא, הוזרקו לעכברים intraperitoneally עם luciferin הדמיה באמצעות מערכת Xenogen. אות מסוים יכול להיות מזוהה עם 1,000 תאים (2 של 6 עכברים הדמיה, איור 2), אבל היה זיהוי אמין יותר עם ​​10,000 תאים (6 מתוך 6 עכברים הדמיה). חשוב לציין כי מחקר זה שימש גם להקים מתאם גס בין מספר בלוציפראז-להביע תאים ועוצמת האות.

> כדי להדגים את התועלת של פרוטוקול המתואר גילוי ומעקב אחר איחוי תאים, MSCs היו transfected עם LoxP-Stop-LoxP-בלוציפראז פלסמיד (Addgene) ונמסרו שריר הלב של Cre-לבטא בעכברים. כשבוע לאחר הלידה התא, העכברים היו הדמיה הראשון באמצעות מערכת Xenogen ללא הזרקה D-luciferin. כצפוי, ללא מצע האנזימטית, עוצמת האות לא זוהה (איור 3). בשלב הבא, D-luciferin שהוזרק intraperitoneally ואת האות המתאימה לעוצמת בלוציפראז ובכך איחוי תאים התגלה בשניים מתוך ארבעה עכברים שנבדקו. איתות דומה התגלתה שבוע מאוחר יותר (איור 3), מה שמרמז MSC מצמידים מוצרים היתוך יכול להישמר in vivo. במקרה זה, המחקר הופסק כדי לאפשר הערכה של הלב הרקמה שמסביב, אבל אפשר לחזות לטווח ארוך ניתוחים הדמיה תכופות יותר כדי לעקוב אחר התפשטות, תחזוקהד אולי הגירה של מוצרים היתוך בעכברים.

באיור 1. סכמטי של טכניקה לזהות Fusion Cell in vivo. היתוך בין אם Cre-לבטא בתאי עכבר התאים המושתלים להביע פלסמיד בלוציפראז floxed מתרחשת, בלוציפראז יבוא לידי ביטוי. בלוציפראז ניתן לאתר על ידי הזרקת המצע האנזימטית, D-luciferin, לעכבר ולאחר מכן הדמיה את העכבר באמצעות הדמיה Biophotonic Xenogen System (מעובד מתוך 19)

באיור 2. רגישות הזיהוי של בלוציפראז-להביע תאים ברקמת הלב עם הדמיה biophotonic. קו תאים אשר constitutively מבטא בלוציפראז (231-Luc-D3H1, Xenogen) נמסר בחלל intramyocardial C57/Bl6 של עכברים שונים מספרים על תא הכולל. נציג תמונות של עכברים מחדשceiving 1 x 10 ^6, 1 ו - ³ x 10 x 10 1 ¹ תאים (משמאל לימין) מוצגים, הדמיה נערך כ -6 שעות לאחר ההזרקה.

באיור 3. כימות בשנת הארה Vivo אינדיקטיביים של Fusion Cell. MSCs היו transfected עם LoxP-Stop-LoxP-בלוציפראז פלסמיד ונמסרו שריר הלב של Cre-לבטא בעכברים. כשבוע ושבועיים לאחר הלידה התא, עכברים Cre היו הדמיה באמצעות מערכת Biophotonic Xenogen הדמיה כדי למדוד את עוצמת הארה מעיד על איחוי תאים. (א) כיסוי של הצילום ואת עוצמת הארה של זיוף ועכברים 1-4 (משמאל לימין) 17 ימים לאחר הלידה התא. (ב) עוצמת הארה של זיוף ועכברים 1-4 (משמאל לימין) 17 ימים לאחר הלידה התא. אזור של אינטרס נבחר (צהוב) המתאים הזריקה ואני עוצמתevels נקבעו באמצעות ImageJ (מקור חינם) תוכנה ^20. (ג) עוצמת הארה היה מנורמל לאזור באותו עניין על זיוף העכבר על כל תנאי הניסוי. באותו שבוע, 3 ו -4 עכברים הראו אות הארה חיובי המצביע על היתוך ספונטני של תא עכבר MSC המושתלים. האות התמיד העכבר 3 ב שבועיים. כדי לקבוע איבר ספציפי לוקליזציה של האות המתאים העכבר 3, חלל בית החזה נחשף ואיברים העיקרי שנכרת הדמיה. (ד) כיסוי של הצילום ואת עוצמת הארה של העכבר 3. הערה לוקליזציה של עוצמת האות במעי הדק. (ה) עוצמת הארה של העכבר 3. (F) כיסוי של הצילום ואת עוצמת הארה של זיוף העכבר. (G) עוצמת הארה של זיוף העכבר.

Discussion

השיטה המתוארת כאן מאפשר, לראשונה, זיהוי וניתוח בדידה הזמני של איחוי תאים באורגניזמים, כולל חיות קטנות. הגישה משלבת Cre-LoxP רקומבינציה עם ניתוח שלאחר מכן תמונה biophotonic. הגישה ניתנת למעקב לא רק תאים תאים היתוך, אלא גם וירוס תאים היתוך ולכן יכול להיות שימושי עבור מעקב אחר זיה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
נאון מערכת transfection	Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה	MPK5000
נאון 100 μL Kit	Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה	MPK10025	מכיל R ו-E הצפת
ממ, אבקת	Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה	12000-022
עוברית שור סרום (FBS)	Hyclone, לוגן UT	SH30070.03
B6.C-Tg (CMV-cre) 1Cgn / J	ג'קסון מעבדה, בר הרבור, ME	006054
10X טריפסין	פישר סיינטיפיק, יער Lawn, NJ	MT-25-054-Cl
L-גלוטמין	פישר סיינטיפיק, יער Lawn, NJ	25030-081
D-Luciferin	Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA	122796
Xenogen מערכת הדמיה Biophotonic	Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA	IVIS ספקטרום
נתרן Biocarbonate	סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי	S6014-500 גרם
שאינם חיוניים חומצות אמינו	Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה	11140-050