Hücre Fusion Tespit Cre-ETOX P Rekombinasyon Yaklaşım In Vivo</em

Özet

, Zaman içinde canlı organizmaların hücre füzyon izlemek için bir yöntem açıklanmıştır. Yaklaşım kullanır Cre LoxP Rekombinasyon hücre füzyonu üzerine lusiferaz ifade ikna etmek için. Periferik dokularda ~ 1.000 hücrelerinin algılama duyarlılığı ile biyofotonik görüntüleme sistemleri kullanılarak canlı organizmalarda üretilir Işıklı sinyal tespit edilebilir.

Özet

Sigorta için aynı tipte iki veya daha fazla hücre yeteneği, iskelet, kas, kemik ve plasenta da dahil olmak üzere pek çok kompleks organ, form, evrim boyunca metazoans kullanılmıştır. Çağdaş çalışmalar aynı tip hücrelerin füzyonu gelişmiş fonksiyonu bahşeder göstermektedir. Örneğin, plasenta sigorta trofoblast hücreleri syncytiotrophoblast formu ne zaman, syncytiotrophoblast daha iyi bir halkaya yapışmamış trofoblast ^1-4 daha maternal-fetal bariyer boyunca besin ve hormonlar taşımak mümkün. Daha yeni çalışmalarda farklı tipte hücrelerin füzyonu, hücre kaderini doğrudan göstermektedir. Füzyon "reversion" veya hücre kaderinin değiştirilmesi kez hücre kültürü sistemleri ile sınırlı olduğu düşünülüyordu. Ama kök hücre nakli gelişi bize keşfine yol açtı ve, kök hücre in vivo somatik hücre ile sigorta ve kök hücre farklılaşması ^füzyon 5-7 kolaylaştırır . Böylece, hücre füzyonu düzenlenmiş bir süreç cböylece, hücre yaşamını ve farklılaşmasını teşvik apable ve gelişme, doku onarımı ve hatta hastalığın patogenezinde için merkezi bir önemi olabilir.

Uygun teknoloji eksikliği) 1, hücre füzyon çalışma sınırlandırılması doğru zaman içinde) izlemek füzyon ürünleri füzyon ürünleri belirlemek ve 2. Burada füzyon üzerine biyoparlaklık indüksiyon (Şekil 1) ile iki kısıtlamalarını ortadan kaldırmak için yeni bir yaklaşım mevcut. Biyoparlaklık in vivo ^8-15 yüksek hassasiyet ile tespit edilebilir bir yapı ateşböceği lusiferaz kodlama kullanır (Photinus pyralis) gen bitişik yerleştirilen bir stop kodon LoxP dizileri ile çevrili. Cre recombinase protein ifade hücreleri ile bu gen sigorta ifade hücreleri LoxP siteleri bölünmüş ve stop sinyali lusiferaz transkripsiyonunu izin eksize edilir. sinyali induci olduğundanble, yanlış pozitif sinyallerin sıklığı çok düşüktür. Cre / LoxP sistemi ^{16, 17} kullanan mevcut yöntemlerden farklı olarak, bir "canlı" bir saptama sinyali dahil ve böylece ilk defa hücre füzyon kinetiği, in vivo olarak takip etme olanağı göze.

Yaklaşım göstermek için, yayg Cre recombinase ifade fareler, bir floxed stop kodon lusiferaz downstream ifade etmek için bir yapı ile transfekte kök hücre alıcıları olarak görev yaptı. Kök hücreler intramiyokardiyal enjeksiyon yoluyla nakledilen ve nakli intravital varlığını izlemek için görüntü analizi yapıldı zaman içinde kalp ve çevresindeki dokularda füzyon ürünleri. Bu yaklaşım, geliştirme, hastalık veya yetişkin doku onarımı herhangi bir aşamasında, herhangi bir doku tipi hücre füzyon analiz adapte olabilir.

Protokol

1. Donör Hücre Transfeksiyon

1. Hasat mezenkimal kök hücreler (MKH, lütfen Dr. Peiman Hematti tarafından bağışlanan H1, embriyonik kök hücrelerinden elde edilen alternatif olarak, in vivo olarak sigorta varsayımla herhangi bir türün herhangi bir hücre tipi istihdam edilebilir) 70 -% 80 1X tripsin ile konfluent (Mediatech 5 dakika için Manassas VA) α-MEM tam orta (ücretsiz, antibiyotik Invitrogen, Carlsbad CA) ¹⁸ tripsin İnaktivasyon. 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüjleyin.
2. Dikkatle supernatant aspirat ve yeniden askıya pelet 1X PBS 1 mL ve bir hemasitometre kullanarak hücre sayımı.
3. 1.5 mL santrifüj tüpüne transfer 1,5 x 10 ⁶ hücre. 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüjleyin.
4. Dikkatle supernatant aspire. R Buffer (Neon Transfeksiyon Sistemi, Invitrogen) ve 6 mg (2 mcg / 5,0 x 10 ⁵ hücre) 300 mcL yeniden süspanse pelet P231 pCMVe betaAc-STOP-luc (Addgene, Cambridge, MA). E Tampon Yeri 3 mL (Invitrüreticinin protokol başına elektroporasyon yerleştirme port (Neon Transfeksiyon Sistemi, Invitrogen) içine ogen).
5. 100 mcL Neon pipetlemeyin ucu hücre plazmid çözüm aktarın ve bir darbe süresi 20 ms ve 1500 volt bir büyüklük ile electroporate. 9.7 mL α-MEM tam orta içeren 15 ml konik bir tüp içine yerleştirin hücreleri electroporated.
6. 10 ml toplam hacmi verim 1.5 iki kez ve havuz transfekte hücreler adımı yineleyin. 10 ml tam orta α-MEM içeren bir T175 balona 10 ml hücre süspansiyonu (1.5 x 10 ⁶ hücre) ekleyin. Elektroporasyon sonra hücre canlılığı, T175 başına yaklaşık 4,5 x ¹⁰ 5 canlı hücreleri verim, yaklaşık% 30'dur .
7. Değişim transfeksiyon şu ortamda 24 saat α-MEM tam.
8. % 80 konfluent (~ 2 - - 3 gün sonra elektroporasyon) Hasat 70 hücreleri transfekte. Bir hemasitometre kullanarak hücre sayımı gerçekleştir ve 1.0 x 10 ⁶ bir konsantrasyon hücreleri tekrar süspansiyonα-MEM tam orta cells/50 mcL. En aza indirmek zaman hücreleri, enjeksiyon için önce hücre ölümü azaltmak için süspansiyon geçirirler.

2. Intramiyokardiyal Enjeksiyon

1. Transgenik fareler üzerinde her hücrede yapısal ifade Cre recombinase (B6.C-Tg (CMV-CRE) 1Cgn / J, Jackson Laboratuvarı, Bar Harbor, mühendislik (Phoenix Pharmaceuticals, Inc, St Joseph, MO) izofluran ile anestezinin neden ME).
2. Saç kesme makineleri veya kimyasal saç çıkarıcı kullanarak göğüs bölgesinden saç çıkarın.
3. - 120 150 mcL bir atım hacmi ile dakikada 130 nefes fare ventilatör 18 gauge kateter (Becton Dickinson & Co, Franklin Göller NJ) ve yeri ile entübe.
4. Böylece bir torakotomi üreten dördüncü interkostal alanı boyunca yatay kesi olun.
5. Kalp görselleştirme, 1 ml şırınga (Temuro Medical Corporation, Somerset, NJ) ve 28 gauge iğne (Bect kullanarak iki transfekte hücre süspansiyonu 25 mcL enjeksiyonlarıDickinson & Co, Franklin Lakes NJ). Intramiyokardiyal enjeksiyon kolaylığı ve organ aşırı zarar görmesini önlemek için, iğne başı ~ 90 derece bükün.
6. Enjeksiyonundan sonra, kaburga ve kas tabakaları kapatmak için emilebilir dikişlerle (örneğin, Vicryl) kullanın. Sütür cilt 4-0 naylon veya ipek kullanılarak kapalı.
7. Fare, anestezi ve ekstübe kurtarmak için izin verin.
8. Kontrol grupları Cre sadece untransfected hücreleri ve transfekte hücreler (alternatif olarak, Cre fareler sigorta eğilimli transfekte hücreleri) alan vahşi tip fareler aynı konsantrasyonda, Cre fareler orta enjeksiyon uygulanan farelerin içermelidir.

3. Biyofotonik Görüntüleme

1. Görüntüleme, intraperitoneal (IP) 15 mg / mL D-luciferase (Kaliper Yaşam Bilimleri, Hopkinton, MA) fare vücut ağırlığının gram başına 10 mcL enjekte beş ile on beş dakika önce.
2. Izofluran üzerinden fareler üzerinde anestezi indüksiyon için% 4 nedenbakım için d 1 -% 2.
3. Yüz maskesi 1 idare ile görüntüleme kutusunda yatar Yeri fareler -% 2 izofluran bakım anestezi (Xenogen biyofotonik Görüntüleme Sistemi, Hopkinton, MA). Birkaç fareler aynı anda görüntülü olabilir. Işıklı sinyal kolay karşılaştırma için deneysel fare ile Resim sahte kontrol fare.
4. Yaşam Görüntü yazılım (Xenogen) kullanarak, uygun pozlama süresi (genellikle 60 sn, bakınız). Farelerin uyum ve duyarlılık değişiklikleri önlemek için, görüntüleme boyunca alanında tutarlı tutmak için görüntü alan ayarlayın. 4.5 cm konu yüksekliğini ayarlayın.
5. Görüş alanı içinde fare ya da fare ile ilgili lüminesans yoğunluğu sinyali Edinme ve değiştirilmemiş görüntü dosyalarını kaydetmek. Süreç görüntüleri bir kontrol ya da unmanipulated fare ile ilgili arka plan sinyali kaldırın. Yoğunluk değerleri yukarıda arka plan hayvan içinde erimiş hücrelere karşılık gelir. Yoğunluk analizi Yaşam Görüntü yazılım (Xenogen) ya da açık kaynak kodlu bir görüntü analiz yazılımı kullanılarak yapılabilir. Typically, ilgi çeken bir bölge (ROI) hayvanlar ve deneyler arasında yoğunluk verileri karşılaştırmak için seçilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Xenogen biyofotonik Görüntüleme Sistemi duyarlılık, yapısal C57/Bl6 fareler (Jackson Laboratory) miyokarda teslim edildi (231-LUC-D3H1, Xenogen) lusiferaz ifade eden bir hücre hattı belirlemek için. Hücreler 1 x konsantrasyonları enjekte edildi 10 ^6, 1 x 10 ³ veya 1 x 10 ¹ hücre hücre teslim Altı saat sonra, fareler luciferase ile intraperitoneal enjekte Xenogen sistemini kullanarak görüntülü edildi. 1000 hücreleri (2 6 fareler, görüntülü Şekil 2) ile özel bir sinyal tespit, ancak algılama 10,000 hücreleri (görüntülü 6 farelerin 6) ile daha güvenilir olabilir. Daha da önemlisi, bu çalışma aynı zamanda lusiferaz ifade hücreleri ve sinyal yoğunluğu sayısı arasında bir kaba ilişki kurmak için görev yaptı.

Hücre füzyon tespit ve izleme açıklanan protokol programını göstermek için MKH (Addgene) LoxP-Stop-LoxP Lusiferaz plazmid transfekte ve Kre-ifade farelerin miyokarda teslim edildi. Hücre doğumdan sonra yaklaşık bir hafta, fare ilk kez D-luciferase enjeksiyon olmadan Xenogen sistemi kullanılarak görüntülenmiştir . Enzimatik substrat olmadan, beklenen, hiçbir yoğunluk sinyali (Şekil 3) tespit edildi. Sonra, D-luciferase intraperitoneal ve lusiferaz yoğunluğuna karşılık gelen bir sinyal enjekte edildi ve böylece hücre füzyonu test iki dört farelerde tespit edildi. Bu durumda, çalışma, kalp ve çevresindeki doku değerlendirilmesi için izin sona erdirildi benzer bir sinyal. MSC-çiftli füzyon ürünleri, in vivo olarak korunabilir, en geç bir hafta (Şekil 3) tespit edildi, ancak bir tasavvur olabilir uzun vadeli bir analiz ve bakım, proliferasyon izlemek için daha sık görüntülemeFarelerde füzyon ürünleri d belki de göç.

Şekil 1. In Vivo Hücre Fusion Algılama Tekniği şematik arasında füzyon Cre ifade fare hücreleri ve nakledilen hücrelerin meydana gelen bir floxed lusiferaz plazmid ifade, lusiferaz ifade edilmesi durumunda. Lusiferaz Xenogen biyofotonik Görüntüleme Sistemi (19 uyarlanmıştır) kullanarak fare fare enzimatik substrat, D-luciferase, enjekte ve daha sonra görüntüleme ile tespit edilebilir

Şekil 2. Tespiti Hassasiyet lusiferaz ifade biyofotonik görüntüleme ile kalp dokusunda hücreler. Yapısal (231-LUC-D3H1, Xenogen) lusiferaz ifade hücre hattı çeşitli toplam hücre sayıları C57/Bl6 farelerin intramiyokardiyal alana teslim edildi. Farelerin Temsilcisi görüntüleri yeniden1 x 10 ^6, 1 x 10 ³ ve 1 x 10 ¹ hücreleri (soldan sağa) ceiving gösterilmiştir, görüntüleme enjeksiyon yaklaşık 6 saat sonra yapıldı.

Şekil 3. Hücre Fusion Endikatif Vivo Lüminesans Niceleme. MKH plazmid LoxP-Stop-LoxP-Lusiferaz ve Kre-ifade farelerin miyokarda teslim ile transfekte. Hücre doğumdan sonra yaklaşık bir hafta ve iki hafta, Cre fareler, hücre füzyonu göstergesidir lüminesans yoğunluğunu ölçmek için Xenogen biyofotonik Görüntüleme Sistemi kullanarak görüntülü. 17 gün hücre doğumdan sonra (A) sham ve fareler 1-4 lüminesans fotoğraf ve yoğunluğu Kaplama (soldan sağa). (B) sham ve fareler 1-4 lüminesans Yoğunluğu (soldan sağa) hücre doğumdan sonra 17 gün. Ilgi bölgeye enjeksiyon yerinde ve yoğunluğu l uygun seçildi (sarı)evels ImageJ (ücretsiz kaynak) yazılımı ²⁰ kullanılarak belirlenmiştir. (C) lüminesans yoğunluğu tüm deneysel koşullar altında, aynı bölgede sahte fare faiz normalize edildi. Bir hafta, 3 ve 4 fareler, bir fare hücre ve nakledilen MSC spontan füzyon düşündüren pozitif lüminesans sinyal gösterdi. Fare 3 sinyali iki hafta devam etti. Fare 3 karşılık gelen sinyal organ belirli bir yeri belirlemek için, göğüs boşluğu maruz kalan ve birincil organları eksize görüntülendi. (D), fotoğraf ve fare 3 lüminesans yoğunluğu Yerleşimi. Not yerelleştirme ince bağırsakta yoğunluğu sinyali. (E) Yoğunluk fare 3 lüminesans. (F), fotoğraf ve sahte fare lüminesans yoğunluğu Yerleşimi. (G) Yoğunluk sahte fare lüminesans.

Tartışmalar

Bu yöntem küçük hayvanlar da dahil olmak üzere, canlılar, ilk kez izin verir hücre füzyonu ayrık tanımlama ve temporal analiz tarif. Bu yaklaşım daha sonraki biyofotonik görüntü analizi ile Cre-LoxP rekombinasyon birleştirir. Sadece hücre-hücre füzyonu izlemeye müsait bir yaklaşım, aynı zamanda virüs hücre füzyonu ve benzeri viral enfeksiyonlar izlemek için faydalı olabilir. Görüntü analizi hızlı ve görüntü aynı anda birden fazla küçük hayvanlar için mümkündür. Füzyon...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Neon Transfeksiyon Sistemi	Invitrogen, Carlsbad, CA	MPK5000
Neon 100 mcL Kiti	Invitrogen, Carlsbad, CA	MPK10025	R ve E Tampon içerir.
a-MEM toz	Invitrogen, Carlsbad, CA	12000-022
Fetal sığır serumu (FBS)	Hyclone, Logan, UT	SH30070.03
B6.C-Tg (CMV-CRE) 1Cgn / J	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME	006054
10X tripsin	Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ	MT-25-054-Cl
L-Glutamine	Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ	25030-081
D-luciferase	Kaliper Yaşam Bilimleri, Hopkinton, MA	122796
Xenogen biyofotonik Görüntüleme Sistemi	Kaliper Yaşam Bilimleri, Hopkinton, MA	IVIS Spektrum
Sodyum Biocarbonate	Sigma Aldrich, St Louis, MO	S6014-500G
Sigara esansiyel amino asitler	Invitrogen, Carlsbad, CA	11140-050