人类体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPS细胞）用绿色荧光蛋白逆转录病毒载体

摘要

的方法来产生人类诱导多能干细胞（iPS细胞）通过逆转录病毒介导的异位表达Oct4的，SOX2的，KLF4和MYC的描述。基于GFP的表达，以确定人类IPSC的殖民地一个切实可行的办法进行了讨论。

摘要

人类胚胎干细胞（胚胎干细胞），多能干细胞在体外疾病建模和再生医学的宝贵来源。它已被先前的研究显示，人体细胞可以被重新编程为多能性异位表达四个转录因子（OCT4，SOX2，KLF4和 Myc），成为诱导多能干细胞（iPS细胞^）2-4。胚胎干细胞一样，人类iPS细胞是多能干细胞和自体细胞的潜在来源。在这里，我们描述的协议进行重新编程人类成纤维细胞克隆到含有GFP的逆转录病毒的骨干⁴四个重编程因素 ​​。使用下面的协议，我们生成人类胚胎培养条件下的人类iPS细胞在3-4周。人类IPSC的殖民地酷似胚胎干细胞形态和逆转录病毒转基因沉默的结果显示，GFP荧光的损失。 IPSC的殖民地下的荧光microsco机械分离体育作为人类胚胎干细胞类似的方式表现。在这些细胞中，我们检测的多的多能性基因的表达和表面标志。

研究方案

1。逆转录病毒重新编程，重编程因子的表达

1. 人成纤维细胞培养成纤维细胞培养基（10％与PEN /链球菌培养液胎牛血清）。
2. 感染前的一天，1×10板⁵到6孔板人成纤维细胞。
3. 抽吸介质，去除死皮细胞和新鲜的成纤维细胞培养基中添加2毫升。在终浓度为5微克/毫升，加入硫酸鱼精蛋白。
4. 仔细地添加适量的每个表达GFP病毒的感染复数^{（MOI）5。}
5. 感染后的一天，清除病毒上清，2毫升PBS洗三次，然后加入2毫升的成纤维细胞培养基。
6. 感染后3天，检查GFP荧光，以及补充成纤维细胞培养基2毫升。
7. 感染四天后，板1×10 ⁴ /厘米²辐照小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）在成纤维细胞培养基中饲养细胞到一个涂有0.1％明胶的10厘米的培养皿。孵育37℃过夜。
8. 五天后感染，感染人成纤维细胞分离与1毫升0.05％胰蛋白酶/ EDTA 5分钟，在37°C间，在200克离心5分钟。抽吸的介质，悬浮细胞，成纤维细胞培养基10毫升。细胞转移到10厘米预涂板。
9. 24小时后，取代胚胎干细胞培养基血清替代20％击倒，DMEM/F12培养液，0.1毫升的非必需氨基酸，4 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子，PEN /链球菌/谷氨酸，β-merceptoethanol的介质。改变中等每日。 ESC - 殖民地将开始出现在感染后20-27天。

2。 iPS细胞的分离和扩展的

1. 荧光显微镜下，检查GFP荧光在殖民地的情况下，显示了一个类似的形态胚胎干细胞。
2. 使用10μL移液器，挑选个别IPSC的殖民地，并放入明胶和MEF-COA特德与胚胎干细胞培养基的12孔板和补充。每天改变介质。
3. 对于传代，用1毫升的DMEM/F12板，再加入0.5毫升胶原酶，孵育10分钟，在37°C
4. 与DMEM/F12培养液洗细胞两次。
5. 加入2毫升的新鲜胚胎干细胞培养基。使用细胞升降机，打破成小块殖民地和分离板的剩余细胞。
6. 转入的明胶涂层和MEF 6孔板殖民地的再悬浮件。

3。多能干标记免疫分析

1. 洗细胞三次，用PBS，并固定为4％多聚甲醛在室温下20分钟。
2. 用PBS轻轻洗细胞三次，通透与0.2％的Triton的PBS X-100的30分钟。
3. 阻止了两个小时，在PBS 3％的BSA孵育细胞非特异性结合。
4. 孵育与小学抗体细胞一夜之间在4°C。
<李>洗细胞三次，用PBS孵育一小时在室温下与特定的二级抗体的细胞，从遮光。
5. 洗细胞与PBS及附加的DAPI随后在室温下孵育5分钟的最后一次洗涤三次。
6. 用荧光显微镜检测染色。

4。为多能干标记实时定量PCR检测

1. 隔离使用Qiagen公司的RNeasy试剂​​盒的人成纤维细胞的人类iPS细胞的总RNA。
2. 合成cDNA第一链的使用上标II逆转录酶。
3. 执行定量PCR检测使用以前报道的引物的全能性基因。

5。代表结果

1. 编程期间的形态学变化
   感染人成纤维细胞与账面OCT4，SOX2，KLF4和MYC基因的逆转录病毒的鸡尾酒BJ1和底特律551，能够探测到的形态学变化，在重新规划（ 图1）。感染后二十一日内，我们承认他们的人类胚胎干细胞一样的形态小IPSC的殖民地。此外，我们认识到iPSCs的GFP荧光。如胚胎干细胞和iPS细胞，多能干细胞表达的分子机制，压制^7-9前病毒基因的表达。我们独特的逆转录病毒载体表达绿色荧光蛋白基因与逆转录病毒LTR的重新编程。因此，持续表达GFP的细胞被认为是没有前病毒基因沉默表达外源基因。忠实地重新编程的IPSC的殖民地获得全能性的分子网络显示的情况下GFP的表达（ 图^2）10。
   
2. 人类iPS细胞的全能性的表征
   我们分析了从底特律-551成纤维细胞与TRA-1-81，TRA-1-60，SSEA-4，SSEA-3，OCT4和NANOG的抗体通过免疫组化派生的殖民地（ 表2）。成功地重新编程的iPS细胞表达所有这些标记（ 图3A）。我们还通过定量RT-PCR分析基因表达分析。我们观察到，表达Oct4的，SOX2的，KLF4基因，MYC和NANOG显着增加父母的成纤维细胞相比，但与H9的胚胎干细胞（ 图3B）。

图1。逆转录病毒感染人成纤维细胞的形态变化。（AD）的进步从底特律-551感染的成纤维细胞重编程因子的菌落的形态变化。第5天（一），第10天（二），第14天（三），（四）21天。细胞显示经过21天的人类胚胎干细胞样形态。

图2。代表GFP荧光表达细胞进行重新编程。 北京和底特律551成纤维细胞感染逆转录病毒表达4个重编程因子^4，四个星期在人类胚胎干细胞培养基中培养。北京成纤维细胞（甲，乙）和底特律551（C和D）显示出类似的形态。从第21天，GFP阴性殖民地开始形成，它代表了真正的¹⁰善意iPSCs的。 （，E，F）显示底特律551没有进行适当的重新编程的细胞转化。在相衬视图（一个C，E）的殖民地。 （B，D）正确地重新编程细胞显示了GFP沉默。 （六）从转化菌落明亮的绿色荧光蛋白表达。

图3。人类诱导多能干细胞的特征。（一）人力551-IPS-K1细胞克隆表达常见的多能干细胞的标记。 DAPI染色显示每场总的单元格的内容。 （二）实时定量聚合酶链反应（RT-QPCR）时间为表达Oct4的，SOX2的，KLF4的，myc在父母f551-IPS-K1 ibroblast，iPS细胞，人类胚胎干细胞和H9（胚胎干细胞）。数据正常化对β-actin的看家基因，并绘制相对表达水平在父母的成纤维细胞^4。

讨论

四个转录因子重编程iPSCs的人类成纤维细胞中的表达。作了许多尝试使用非集成或者非遗传方法来生成临床安全iPSCs的人类iPS细胞生成。到目前为止，这些方法效率极低，需要进一步优化，提高了重复性^11-14。复古或慢病毒的方法，很容易获得和运用人类iPS细胞， 在体外的疾病模型，这是减少病毒整合所造成的安全问题上的依赖。重新编程的方法，这里描述的是人类iPS细胞的效率推?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Knockout Serum Replacer	Invitrogen	10828-028	20%
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Nonessential Amino Acids (10 mM)	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, by Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
Table 1. Culture Medium
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Flur 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Flur 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Collagenase type IV	Invitrogen	17104019	1mg/ml
Gelatin, Porcine	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
MEF feeder cells	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter
Table 2. Reagents and equipment