GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Özet

OCT4 bir retrovirüs-aracılı ektopik ifadesi ile insan kaynaklı hücreler pluripotent kök (iPSCs) üretmek için bir yöntem olup, SOX2, KLF4 ve MYC tarif edilmektedir. GFP dayanarak insan iPSC koloniler tespit etmek pratik bir yolu da tartışılmaktadır.

Özet

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) pluripotent ve in vitro hastalığı modelleme ve rejeneratif tıp ¹ de için paha biçilmez bir hücresel kaynaklarıdır. Daha önce insan somatik hücre dört transkripsiyon faktörlerinin ektopik ifade (Oct4, Sox2, Klf4 ve Myc) tarafından pluripotency yeniden yapılandırılabilir ve uyarılan pluripotent kök hücreler (iPSCs) ^2-4 olabildiği gösterilmiştir. HESC gibi, insan iPSCs pluripotent ve otolog hücre için potansiyel bir kaynaktır. Burada GFP içeren retroviral omurgası ⁴ klonlanmış dört yeniden programlama faktörleri ile insan fibroblast hücreleri yeniden programlamayı protokolü tanımlar. Aşağıdaki protokolü kullanarak, insan ESC kültür koşullarında 3-4 hafta içerisinde insan iPSCs oluşturur. İnsan iPSC koloniler yakından morfolojisi hESC benzeyen ve retroviral transgen susturulması bir sonucu olarak GFP flöresanı kaybı gösterir. iPSC koloniler bir floresan microsco altında mekanik olarak izolepe hESC gibi benzer bir şekilde davranırlar. Bu hücreler, biz çok pluripotency genlerin ve yüzey belirteçleri ifadesi algılar.

Protokol

1. Yeniden programlanması Faktörler ifade Retrovirus tarafından yeniden programlama

1. İnsan fibroblastlar fibroblast ortamı (10% Pen / Strep ile DMEM içinde FBS) kültürlenmiştir.
2. 6-iyi plaka iyi birine enfeksiyonu bir gün önce, plaka 1x10 ⁵ insan fibroblastları.
3. Ölü hücreleri çıkarmak ve taze fibroblast orta 2 ml eklemek için orta aspire. 5 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyon protamin sülfat ekleyin.
4. Dikkatli bir enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) ⁵ 5 karşılık gelen her GFP-ifade virüs uygun miktarda ekleyin.
5. 2 ml fibroblast orta ekleyin, bir gün sonra enfeksiyon, viral süpernatant kaldırmak 2 ml PBS ile üç kez yıkayın.
6. Üç gün enfeksiyondan sonra, GFP flöresanı kontrol etmek ve 2 ml fibroblast ortam ile de takviye.
7. Bir üzerine fibroblast ortamda dört gün enfeksiyondan sonra, plaka 1x10 ışınlanmış fare embriyonik fibroblast ⁴ / cm ² (MEFS) besleyici hücreler10-santimetrelik bir petri tabağına% 0.1 jelatin ile kaplanır. 37 ° C'da gece boyunca inkübe edilir.
8. Beş gün enfeksiyondan sonra, 1 ml% 0.05 typsin / EDTA 5 dakika boyunca 37 ° C'de ve 200 g hızında 5 dakika boyunca santrifüj ile enfekte insan fibroblastlar ayırmak. Ortamı aspire ve fibroblast orta 10ml ile tekrar süspansiyon hücreleri. Bir ön-kaplamalı 10 cm-plakası içine hücreleri transfer edin.
9. 24 saat sonra, hESC kültür ortamı (% 20 Knock-Out serum yerine, DMEM/F12, 0.1 ml Esansiyel olmayan amino asitler, 4 ng / ml bFGF, Pen / Strep / Glutamat, beta-merceptoethanol) ile orta yerine. Günlük orta değiştirin. ESC gibi koloniler enfeksiyondan sonra günde 20-27 tarafından görünmeye başlayacaktır.

2. IPSCs izolasyonu ve Genişletme

1. Bir floresan mikroskop altında, hESC benzer bir morfoloji gösteren bir kolonide GFP floresans olmaması için kontrol edin.
2. Bir 10 ul pipet kullanarak, bireysel iPSC koloniler almak ve bir jelatin ve MEF-COA iyi birine koyunted 12-iyi plaka ve hESC orta ile desteklenmiş. Günlük orta değiştirin.
3. Pasajlanmasını için, DMEM/F12 1 ml yıkama plakası, daha sonra kollajenaz 0.5 mL, 37 ve 10 dakika boyunca kuluçkaya ° C.
4. DMEM/F12 ile iki kez yıkanır hücreleri.
5. Taze hESC orta 2 ml ekleyin. Bir hücre hırsızı kullanarak, küçük parçalar halinde koloniler parçalamak ve plakadan kalan hücreler ayırmak.
6. Jelatin ve MEF kaplı 6-iyi plaka iyi birine kolonilerin süspanse adet aktarın.

3. Pluripotent Markers immünofloresan Analizi

1. PBS ile üç kez yıkanır hücreleri ve oda sıcaklığında 20 dakika için% 4 paraformaldehit ile sabitlemek.
2. Yavaşça ile% 0.2 Triton 30 dakika süreyle PBS içinde X-100. PBS ile üç kez hücreleri yıkayıp geçirgenliği
3. Iki saat süreyle PBS içinde% 3 BSA ile kuluçkaya hücreleri tarafından spesifik olmayan bağlanma bloke eder.
4. 4 'de bir gece primer antikor ile birlikte inkübe hücreleri ° C.
5. PBS ile üç kez yıkanır hücreleri ve ışıktan koruyucu, oda sıcaklığında bir saat boyunca belirli bir sekonder antikor ile hücreleri inkübe edilir.
6. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi, son yıkama sırasında PBS ve eklentinin DAPI ile hücreleri, üç kez yıkanır.
7. Bir floresan mikroskop ile boyama algılar.

4. Pluripotent Markers için Kantitatif Real-time PCR

1. Qiagen Kullanıcı RNeasy kiti kullanılarak, insan fibroblastlarının türetilmiş insan iPSCs toplam RNA izole edin.
2. Üst Simge II Reverse Transcriptase kullanarak ilk iplikli cDNA sentez.
3. Daha önce rapor primerler kullanılarak pluripotency genleri tespit etmek qPCR gerçekleştirin. ⁶

5.. Temsilcisi Sonuçlar

1. Yeniden programlama sırasında Morfolojik değişim
   Biz OCT4, SOX2, KLF4 ve MYC taşıyan retrovirüslerin bir kokteyl ile insan fibroblastları BJ1 ve Detroit 551 enfekteve (Şekil 1) yeniden programlama sırasında morfolojik değişiklikler tespit edebildi. Yirmi bir gün enfeksiyondan sonra, onların hESC benzeri morfolojisi ile küçük iPSC koloniler farkındayız. Ayrıca, GFP floresan iPSCs farkındayız. Böyle EKH ve iPSCs olarak pluripotent kök hücreler, proviral gen ^7-9 bastırmak için moleküler makineler ifade. Bizim eşsiz retroviral vektörü retroviral LTR genleri yeniden programlama ile birlikte GFP ifade eder. Böylece sürekli GFP salgılayan hücrelerin proviral gen suskunluğu olmadan transgenlerin ifade etmek için kabul edilir. Pluripotency moleküler ağ elde Sadakatle reprogrammed iPSC koloniler GFP (Şekil 2) ¹⁰ olmadığını göstermektedir.
   
2. Insan iPSCs ve pluripotency Karakterizasyonu
   Biz Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, OCT4 ve NANOG antikorlar (imünohistokimya ile Detroit-551 fibroblastlar türetilen koloniler analiz Tablo 2). Başarıyla yeniden programlanması iPSCs bu belirteçler (Şekil 3A) tüm ifade. Ayrıca, kantitatif RT-PCR analizi ile gen ifadesi analiz edilmiştir. Biz OCT4 ifadesi, SOX2, KLF4, MYC ve NANOG anlamlı ebeveyn fibroblast hücreleri ile karşılaştırıldığında artmış ancak H9 hESC (Şekil 3B) bu ile orantılı olduğu görülmektedir.

Şekil 1.. Retrovirüs-enfekte insan fibroblastları morfolojik değişiklikler. (AD) yeniden programlama faktörleri ile enfekte Detroit-551 fibroblastlardan koloniler Progressive morfolojik değişim. Gün 5 (A), 10 gün (B), Günlük 14 (C), günde 21 (D). Hücreler 21 gün sonra hESC benzeri morfoloji göstermektedir.

Şekil 2. Reprogramming giren hücrelerde Temsilcisi GFP floresan ifade. BJ ve Detroit 551 fibroblastlar retrovirüs dört yeniden programlama faktörleri ⁴ ifade ile enfekte ve dört hafta boyunca hESC ortamda inkübe edildi. BJ fibroblast (A, B) ve Detroit 551 (C, D) morfolojik benzer göstermektedir. Günlük 21, GFP negatif koloniler iyi niyetli iPSCs ¹⁰ temsil eden oluşturmaya başlar. (E, F) uygun reprogramming uğramamış Detroit 551 hücreler dönüştürdü göstermektedir. Faz kontrast görünümü altında (A, C, E) koloniler. (B, D) düzgün GFP susturulması göstermek hücrelerin yeniden programlanması. Transforme koloni (F) parlak GFP.

Şekil 3. Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin karakterizasyonu. (A) İnsan 551-iPS-K1 hücre kolonilerinin pluripotent hücreler için ortak işaretleri ifade. DAPI boyama alan başına toplam hücre içeriğini gösterir. Ebeveyn f (B) Kantitatif gerçek OCT4 ifade için zaman-PCR (RT-qPCR), SOX2, KLF4, MYCibroblast, 551-iPS-K1 iPSCs ve H9 insan embriyonik kök hücreleri (hESC). Veri β-aktin housekeeping gen karşı normalize ve ebeveyn fibroblast hücreleri ⁴ ifadesi seviyesine göre çizildi.

Tartışmalar

IPSCs dört transkripsiyon faktörleri reprograms insan fibroblast Anlatım. Pek çok klinik deneme güvenli iPSCs üretmek için non-entegre olan ya da olmayan genetik yaklaşım kullanılarak insan iPSCs üretmek için yapılmıştır. Şimdiye kadar, bu yöntemler son derece düşük verimlilik göstermek ve tekrarlanabilirlik ^11-14 geliştirmek için daha fazla optimizasyon gerektirir. Retro-ya lentiviral yöntemlerle kolayca elde ve viral entegrasyon kaynaklanan sorunları emniyet az bağımlı olan ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Knockout Serum Replacer	Invitrogen	10828-028	20%
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Nonessential Amino Acids (10 mM)	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, by Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
Table 1. Culture Medium
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Flur 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Flur 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Collagenase type IV	Invitrogen	17104019	1mg/ml
Gelatin, Porcine	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
MEF feeder cells	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter
Table 2. Reagents and equipment