תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Summary

שיטה ליצירת אדם המושרה גזע pluripotent תאים (iPSCs) דרך לביטוי רטרווירוס בתיווך חוץ רחמי של OCT4, Sox2, KLF4 ו myc מתואר. באופן מעשי לזיהוי מושבות iPSC אדם המבוססים על ביטוי של GFP נדון גם.

Abstract

בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) הם pluripotent ו כ מקורות הסלולר שלא יסולא בפז עבור בדוגמנות המחלה במבחנה ברפואה רגנרטיבית ^1. הוכח בעבר כי האדם תאים סומטיים ניתן לתכנות מחדש כדי pluripotency ידי ביטוי אקטופי של ארבעה גורמי תעתוק (Oct4, Sox2, Klf4 ו myc) ולהיות המושרה על גזע pluripotent תאים (iPSCs) ^2-4. כמו hESCs, iPSCs האדם pluripotent ומקור פוטנציאל תאים עצמיים. כאן אנו מתארים את פרוטוקול לתכנת מחדש תאים פיברובלסטים אדם עם ארבעה גורמים תכנות מחדש משובטים לתוך עמוד השדרה-GFP המכיל retroviral ^4. באמצעות פרוטוקול הבאה, אנחנו מייצרים iPSCs האדם 3-4 שבועות בתנאי ESC התרבות האנושית. אדם מושבות iPSC דומים hESCs ב המורפולוגיה להציג הפסד של ה-GFP הקרינה כתוצאה ההשתקה transgene retroviral. מושבות iPSC מבודדים מכנית תחת microsco הקרינהPE להתנהג באופן דומה hESCs. בתאים אלה, אנו מזהים את הביטוי של גנים pluripotency מספר סמנים פני השטח.

Protocol

1. תכנות מחדש של רטרווירוס הבעת גורמים תכנות מחדש

1. Fibroblasts אדם מתורבתים במדיום פיברובלסטים (10% FBS ב DMEM עם עט / דלקת).
2. יום אחד לפני הזיהום, 1x10 צלחת ⁵ fibroblasts אדם לתוך אחד גם צלחת של 6 באר.
3. Aspirate בינוני להסיר תאים מתים ומוסיפים 2 מ"ל של מדיום פיברובלסטים טרי. הוסף סולפט protamine בריכוז הסופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל.
4. בזהירות להוסיף את הכמות המתאימה של וירוס ה-GFP, להביע את כל המתאים ריבוי של זיהום (משרד הפנים) 5 ^5.
5. יום אחד לאחר ההדבקה, הסר supernatant ויראלי, לשטוף שלוש פעמים עם 2 מ"ל PBS, ולאחר מכן להוסיף 2 פיברובלסטים בינוני מ"ל.
6. שלושה ימים לאחר ההדבקה, לבדוק את הקרינה GFP ומלאו היטב עם המדיום 2 פיברובלסטים מ"ל.
7. ארבעה ימים לאחר ההדבקה, צלחת 1x10 ^4/2 ס"מ של פיברובלסטים העכבר מוקרן עובריים (MEFs) מזין תאים פיברובלסטים בינוני על גבי10 ס"מ צלחת פטרי מצופה 0.1% ג'לטין. דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
8. חמישה ימים לאחר ההדבקה, לנתק fibroblasts אדם שנדבקו 1 מ"ל 0.05% typsin / EDTA במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ועל צנטריפוגות במשך 5 דקות בכל 200 גרם. Aspirate בינוני resuspend את התאים עם 10 מ"ל של מדיום פיברובלסטים. להעביר את התאים לתוך צלחת של 10 ס"מ מראש מצופה.
9. לאחר 24 שעות, להחליף בינוני עם בינוני hESC תרבות (20% נוק אאוט החלפת בסרום, DMEM/F12, 0.1 מ"ל לא חיוניות חומצות אמינו, 4 ng / ml bFGF, עט / דלקת / גלוטמט, בטא merceptoethanol). שנה בינונית מדי יום. ESC כמו מושבות יתחיל להופיע 20-27 יום לאחר ההדבקה.

2. בידוד והרחבת iPSCs

1. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, בדוק בהעדר GFP הקרינה במושבה המציג מורפולוגיה דומה hESCs.
2. בעזרת פיפטה μl 10, לקחת מושבות iPSC בודדים ומניחים אותם לתוך אחד טוב של ג'לטין ו-MEF-CoAטד 12 גם הצלחת להשלים עם המדיום hESC. שנה בינונית מדי יום.
3. עבור passaging, לשטוף את הצלחת עם 1 מ"ל של DMEM/F12, ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ"ל של collagenase, ו דגירה במשך 10 דקות ב 37 ° C.
4. שוטפים את התאים פעמיים עם DMEM/F12.
5. הוסף 2 מ"ל של מדיום hESC טרי. באמצעות מרים תאים, לפרק את המושבות לחתיכות קטנות ולנתק התאים הנותרים מהצלחת.
6. מעבירים את חתיכות resuspended של מושבות לאחד גם צלחת 6-גם ג'לטין ו-MEF מצופה.

3. ניתוח immunofluorescence של סמנים pluripotent

1. שוטפים את התאים שלוש פעמים עם PBS ולתקן עם paraformaldehyde 4% עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
2. לשטוף בעדינות את התאים שלוש פעמים עם PBS ו permeabilize עם. 0.2% טריטון X-100 ב PBS למשך 30 דקות
3. חסום שאינם ספציפיים מחייב דוגרים על ידי תאים עם BSA 3% ב PBS במשך שעתיים.
4. דגירה התאים עם הנוגדנים העיקרי בין לילה ב 4 ° C.
5. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ו דגירה התאים עם נוגדן ספציפי משנית למשך שעה בטמפרטורת החדר, מיגון מפני אור.
6. שוטפים את התאים שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף DAPI במהלך הכביסה האחרונה ואחריו הדגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
7. זיהוי כתמים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

4. כמותי בזמן אמת PCR Assay עבור סמנים pluripotent

1. לבודד RNA הכולל את iPSCs האדם הנגזרות fibroblasts אדם באמצעות ערכת RNeasy של Qiagen.
2. לסנתז גדיל 1-cDNA באמצעות כתב עילי transcriptase השני הפוך.
3. בצע QPCR לזהות גנים pluripotency באמצעות primers שדווח קודם לכן. ⁶

5. נציג תוצאות

1. שינוי מורפולוגי במהלך תכנות מחדש
   אנחנו נגועים fibroblasts אדם BJ1 ודטרויט 551 עם קוקטייל של רטרווירוסים הנושאים OCT4, Sox2, KLF4 ו myc,והיו מסוגלים לזהות שינויים מורפולוגיים במהלך תכנות מחדש (איור 1). עשרים ואחד ימים לאחר ההדבקה, אנו מכירים iPSC מושבות קטנות על ידי המורפולוגיה שלהם hESC דמוי. יתר על כן, אנו מכירים iPSCs על ידי הקרינה ה-GFP. בתאי גזע pluripotent, כגון ESCs ו iPSCs, להביע את המנגנון המולקולרי להדחיק ביטוי גנים proviral ^7-9. וקטור retroviral הייחודי שלנו מבטא את ה-GFP ביחד עם תכנות מחדש הגנים על ידי LTR retroviral. לכן, תאים המבטאים באופן רציף GFP נחשבים להביע transgenes ללא להשתקת גנים proviral. מושבות iPSC לתכנות מחדש באמונה לרכוש את רשת מולקולרית pluripotency להראות העדר ביטוי של GFP (איור 2) ^10.
   
2. אפיון pluripotency של iPSCs אדם
   ניתחנו מושבות שמקורם דטרויט-551 fibroblasts באמצעות אימונוהיסטוכימיה עם Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, ו OCT4 נוגדנים Nanog ( לוח 2). IPSCs לתכנות מחדש בהצלחה לבטא את כל אלה סמנים (איור 3 א). אנחנו גם ניתח ביטוי גנים באמצעות ניתוח RT-PCR כמותי. הבחנו כי ביטוי OCT4, Sox2, KLF4, myc ו Nanog הוגדל באופן משמעותי לעומת תאים פיברובלסטים ההורים אבל בקנה אחד עם זו של H9 hESCs (איור 3 ב).

באיור 1. שינויים מורפולוגיים של רטרווירוס נגועים fibroblasts אדם. (AD) שינוי מורפולוגי מתקדמת במושבות מדטרויט-551 fibroblasts נגועים גורמים תכנות מחדש. יום 5 (א), יום 10 (ב) יום 14 (ג), ביום 21 (ד). תאים להראות מורפולוגיה hESC כמו לאחר 21 יום.

איור 2. נציג ה-GFP ביטוי ניאון בתאים שעברו תכנות מחדש. ב"ג ודטרויט 551 fibroblasts נדבקו רטרווירוס להביע ארבעה גורמים תכנות מחדש ^4, ו מודגרות במדיום hESC במשך ארבעה שבועות. Fibroblasts ב"ג (א, ב) ודטרויט 551 (ג', ד ') להראות דומה מורפולוגית. מיום 21, מושבות GFP שליליים מתחילים להיווצר, אשר מייצגים את iPSCs חרוצים וישרי דרך ^10. (E, F) הצג הפכה דטרויט 551 תאים שלא עברו תכנות מחדש הנכון. (A, C, E) מושבות תחת התצוגה בניגוד שלב. (B, D) לתכנות מחדש כראוי התאים המציגים השתקת ה-GFP. (ו) ה-GFP ביטוי בהיר מהמושבה טרנספורמציה.

איור 3. אפיון של תאים אנושיים גזע המושרה pluripotent. (א) אדם 551-IPS-K1 מושבות תאים להביע סמנים משותפים לתאי גזע pluripotent. מכתים DAPI מעיד על התוכן הסלולרי הכולל לכל שדה. (ב) כמותי בזמן אמת-PCR (RT-QPCR) עבור ביטוי OCT4, Sox2, KLF4, myc בפה ההורים, ibroblast 551-IPS-K1 iPSCs ו H9 תאים אנושיים גזע עובריים (hESCs). הנתונים היו מנורמל נגד הגן β-אקטין משק בית זממו יחסית לרמה ביטוי בתאי פיברובלסטים ההורים ^4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הביטוי של ארבעה גורמי תעתוק fibroblasts reprograms אדם עד iPSCs. ניסיונות רבים נעשו כדי לייצר iPSCs אדם באמצעות שילוב גישות שאינם או לא גנטית כדי לייצר iPSCs בטוח מבחינה רפואית. עד כה שיטות אלה מראים יעילות נמוכה מאוד ודורשים אופטימיזציה נוספת כדי לשפר את שחזור ^11-14. שיטות רטרו או l...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Knockout Serum Replacer	Invitrogen	10828-028	20%
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Nonessential Amino Acids (10 mM)	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, by Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
Table 1. Culture Medium
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Flur 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Flur 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Collagenase type IV	Invitrogen	17104019	1mg/ml
Gelatin, Porcine	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
MEF feeder cells	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter
Table 2. Reagents and equipment