细胞迁移的的Phagokinetic轨道运动MLCK的定量评价

摘要

phagokinetic蠕动轨道法是一种方法，用于评估细胞的运动。具体而言，测定测量化学增活现象（随机细胞运动性），以定量的方式随着时间的推移。该试验利用细胞的能力，以建立一个可测量其运动轨迹胶体金涂覆盖玻片。

摘要

单细胞和多细胞生物体细胞的活力是一个重要的生物过程。它的来源的营养物或远离不适合的条件，以及在多细胞生物组织的发展，免疫监视和伤口愈合，只是提了几个角色^1,2,3的单细胞生物向运动是必不可少的。撤销这个过程可能会导致严重的神经系统，心血管疾病和免疫系统疾病，以及加剧了肿瘤的形成和传播^4,5。分子，肌动蛋白聚合和受体回收已被证明发挥了重要作用，在细胞的扩展名（片状伪足），即推动向前运动的细胞^6,7,8。然而，许多生物细胞迁移的问题仍然没有答案。

在人类健康和疾病的细胞运动中的核心作用突出的重要性，了解具体的MEChanisms参与了这一过程，并作出准确的方法来评估细胞的运动，特别是重要。显微镜通常是用于可视化细胞的运动。然而，细胞移动相当缓慢，耗费资源的过程，需要昂贵的相机和软件创建时间的推移定量电影运动细胞的细胞迁移的定量测量。因此，进行定量测量细胞迁移，是符合成本效益的，不费力，而且采用了常见的实验室设备的能力是一个伟大的许多研究人员的需要。

phagokinetic轨道蠕动测定法利用能力的移动单元以清除金颗粒，从它的路径建立一个可测量的磁道上的胶体金涂覆的玻璃盖玻片^9,10。使用的自由软件，可以评估多个音轨，每次治疗完成统计的要求。该试验可以用来评估许多类型的细胞，如癌细胞^11,12，成纤维细胞^9，嗜中性粒细胞^13，骨骼肌细胞^14，角质形成细胞^15，的滋养层^16，血管内皮细胞^17，和单核细胞^10,18-22能动性。该协议涉及创建由柠檬酸钠，氯金酸（互惠^{3 +）}的减少所生成的金纳米粒子（互惠°）涂覆的幻灯片。这种方法的开发由Turkevich 等人于1951年^23，然后在20世纪70年代的改善Frens 等^。24,25。作为一个结果，该化学还原步骤中，金颗粒（10-20 nm直径）从反应混合物中沉淀，并可以应用到玻璃盖玻片，然后准备用于在细胞迁移分析^9,26,27。

在一般情况下，phagokinetic轨道蠕动法是一种快速，定量和容易的细胞能动性的措施。此外，它可以用来作为一个简单的高通量的检测，使用的细胞类型，不适合时间推移的成像，以及其他用途，取决于需要的研究员。一起，定量地测量多种细胞类型的细胞运动，而不需要昂贵的显微镜和软件的能力，以及常见的实验室设备和化学品的使用，作出的phagokinetic的轨道活力测定了坚实的选择，有兴趣的科学家了解细胞蠕动。

研究方案

1。明胶涂层的盖玻片的制备

1. 放置酸洗玻璃盖玻片（15毫米直径），在无菌塑料100mm皿（晚餐）。将每道菜8-9盖玻片，并确保他们不接触对方或双方的菜..

注：盖玻片，针和镊子必须是无菌的，以消除可能的污染的微生物，以及内毒素，这将影响细胞功能，包括蠕动。

2. 称量明胶粉末，并重新悬浮在去离子水中的粉末，使明胶溶液的最终浓度为0.5 g/300毫升。接着，将明胶溶液需要以进行高压灭菌。
3. 移取2-3滴明胶（约100-150毫升），每个盖玻片上。

注意：请小心不要让明胶触摸盘，否则您将无法从盘子里取出盖玻片。

4. 烘烤10分钟在90℃下在烘箱中在100毫米培养皿明胶包衣的盖玻片。
5. 删除多余的，食用明胶温柔的移液。
6. 45分钟，在100毫米的培养皿在烘箱中在70℃下干燥盖玻片。
7. 一旦干时，取出盖玻片100毫米的盘使用无菌，无内毒素针和镊子（针是用来轻轻上调盖玻片，使其访问的镊子轻轻取出）。
8. 将个人明胶包被盖玻片的24孔板到单独的井。

2。制备胶体金涂层盖玻片的

1. 称取适量的氯金酸（四氯金酸三水合物; HAuCl _{4·3H 2 O），}然后重新悬浮于无菌的去离子水，以制备最终的14.5 1mM溶液（毒性）。准备1.5毫升的溶液每8-9盖玻片。

警告：氯金酸为h抱吞咽，引起严重的皮肤灼伤和眼睛损伤，并可能导致皮肤过敏反应。吞食有毒。

2. 称取适量的柠檬酸钠（磷酸三钠二氢2 -羟基丙烷-1，2,3 -三甲酸三乙酯;的Na ₃ C ₆ H ₅ O _7），然后重新悬浮在去离子水中的粉末作最后的0.5％的溶液。准备1毫升的溶液每8-9盖玻片。

警告：柠檬酸钠可能会引起眼睛和皮肤有刺激性。它也可能导致呼吸道和消化道的刺激。

3. 在无菌的，无内毒素的烧杯中的1.5毫升的无菌14.5 mM的HAuCl ₄溶液和13.5毫升的无菌去离子水相结合;结果应该得到淡黄色溶液。上述量将允许8-9胶体金盖玻片。
4. 在连续搅拌的同时，在热板上加热该溶液，直到它开始到b油。

警告：加热该溶液应在通风橱中进行，如可以是蒸气的有害/有毒。蒸气组织的粘膜和上呼吸道有破坏性的。

5. 删除从热板的烧杯中。
6. 在搅拌的同时，加入0.7毫升的0.5％柠檬酸钠溶液中。上述量将允许8-9胶体金盖玻片。
7. 保持这种组合的解决方案搅拌约2分钟（注：溶液颜色会逐渐改变，从淡淡的黄色，清除，灰色，紫色，深紫色，最后才到达红葡萄酒，最好是铁锈色） 。该产品是您的胶体金溶液。
8. 冷却的10毫升移液管的胶体金溶液中1-2分钟（为了保持盖玻片的明胶层上时，从熔化的胶体金溶液中加入），然后加入1.0-2.0毫升的colloida升金溶液到每个明胶包被的盖玻片放置在24孔板（ES）（您添加量的胶体金溶液的明胶包被的盖玻片上取决于如何以及在溶液中的金颗粒沉淀 - 下面的评论）。

注意：因为有可能会对在金颗粒沉淀的效率的变化，它是表示第一次添加的胶体金溶液的明胶包衣盖玻片0.5-1毫升，0.5小时，然后放置在24孔培养皿中孵化器。此温育时间后，应检查盖玻片，在光学显微镜下，适当的密度的金颗粒上的盖玻片。过低和过高的浓度的金颗粒的实施例的20倍的显微镜图像，参见图1。请参阅图2为一个理想的浓度的金颗粒（至少用于与单核细胞）的40倍的显微镜图像。巴勒斯坦被占领土IMAL在幻灯片上的金纳米粒子密度应使用每种细胞类型的实验确定的，作为不同的细胞的特性将决定他们的运动的强度上的盖玻片。如果金颗粒的浓度是不足的，增加一个额外的胶体金溶液的明胶包衣盖玻片0.5-1毫升。

根据细胞的大小，适当浓度的金颗粒可以不同，从而将最终依赖于细胞的大小检查蠕动。例如，与人单核细胞是小尺寸的细胞（〜10-20微米^28），需要更高浓度的金颗粒在我们的分析。黄金纳米粒子的适当分配为研究人员提供了简单而有效的区分边缘细胞的轨道。甲金颗粒浓度太高会妨碍细胞的能力，移动，因此，准确地测量他们的蠕动，而金颗粒的浓度过低限制的能力划定一个准确的跟踪蠕动。

重要注意事项：如果是有问题的黄金纳米粒子的合成，合成的纳米金是市售的尺寸从5纳米到400纳米。此外，荧光微球也被用来研究细胞运动^29。但是，这些微球的使用需要分析细胞迁移的荧光显微镜。

9. 与胶体金覆盖的盖玻片的培养箱中放置24孔培养皿，在37℃下孵育1小时至过夜。
10. 孵育后，冲洗/通过浸渍到无菌的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中的的盖玻片（3×），除去未结合的金。
11. 将这些胶体金涂层盖玻片，在一个干净的12孔板（ES）的PBS。
12. 将这些盖玻片，在4°C，直到准备（封口膜板放置在冰箱前）。

重要注意：始终保持在某种类型的液体/介质的胶体金涂覆盖玻片作为金颗粒剥落从盖玻片，如果让其干燥。胶体金盖玻片，应使用之日起，他们在2-3个月内。

质量控制：在一个单一的phagokinetic轨道蠕动测定，它是由一个类似的浓度的金颗粒，其特征在于使用的盖玻片的关键。这个简单的点，将允许在蜂窝蠕动样品之间的定量差异的性质的处理，而不是胶体金涂层盖玻片的物理性质是纯粹由于。我们赞成使用只在个别的实验中在同一时间所作的盖玻片，虽然我们已经表明，只要金纳米粒子的密度是相等的，使用盖玻片从不同的制剂是适当的。

3。细胞运动分析

1. 将胶体金涂层盖玻片放置在一个适当的蜂窝媒体所关注的细胞。
2. 适当的处理后的细胞转移到胶体金涂层的盖玻片放置在24孔培养皿（晚餐）

注：转移到单井细胞的数目，需要确定每种细胞类型的研究。理想的情况下，细胞需要平均分布在胶体金涂层盖玻片，这反过来将允许创建的单个单元格的唯一的磁道的统计分析。如果细胞接种于浓度太高，它变得很可能发生的，将要看到的多个小区的重叠轨道。重叠的轨迹不能准确地定量，因此，它们不能被考虑在最后的分析测试细胞的移动。作为一个结果，重叠轨道参与多个细胞通常是很容易观察到，作为合并或划线的轨迹（在分析领域内的），其中两个或更多的细胞中可以观察到相同的连续清除区域。

3. 孵育在37℃，C / 5％CO ₂的24小时（或任何合适的时间， 例如，我们已经分析在6小时和24小时的后处理和血管内皮细胞在12小时后处理）之间的单核细胞蠕动。会随着研究的细胞类型，因此应通过实验确定了不同的细胞类型（一个很好的起点，但是，是6 - 12小时后处理）的确定和测量细胞运动的最佳时间框架。

注：如果实验胶体金涂覆盖玻片需要将被存储和/或分析在稍后的时间，将细胞和金纳米粒子需要被固定在盖玻片。要做到这一点固定步骤;以下步骤3.3，先洗盖玻片仔细的2倍，1倍PBS（浸渍盖玻片是可取的，因为，从盖玻片必须避免的黄金纳米粒子的去除），然后使用标准的细胞固定方法，如3％的多聚甲醛室温孵育。孵育15分钟后，被删除的3％的多聚甲醛和盖玻片仔细洗3次，用1×PBS。可以保存在冰箱中的固定盖玻片。

4. 使用光学显微镜，拍摄图像创建一个移动单元格（注：用于细胞的轨道拍照，放大倍率肯定会有所不同的细胞类型根据调查）的轨道。在图2中所示的实施例的蜂窝轨道创建的非能动和能动的细胞对胶体金涂层盖玻片。

注：phagokinetic轨道蠕动测定中使用的大小的金纳米粒子已被发现是完全无毒的细胞^30。如果有必要进行评估的可行性研究细胞台盼蓝染色或其他标志物检测细胞活力。人们必须考虑到需要为固定，固定型等，如果需要进行这一步。

5. 使用免费的软件，如ImageJ软件（ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ）或NIH图像（ http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ）的，无论是发达国家在美国国立卫生研究院（ http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ） ，或ImageTool的大学，得克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥，清除胶体金的平均面积（任意单位） 10-20或更多的细胞（每个样品）确定为每个实验臂从所捕获的图像。在T就可以进行统计他收集的结果。例如，结果可以绘制为意味着±的标准误差的装置（SEM）与学生的 t测试执行，和一个P值，<0.05作为统计意义样品之间的措施。 图3和4展示的步骤在清除由该单元的胶体金的区域分析。

结果

所示出的是示出了轨道区清零由一个单一的细胞（单核细胞从我们的实验是在图2中所示）在光学显微镜下拍摄的图像的一个例子。非运动细胞创建特征的小，椭圆形或圆形大片自己周围指示低基础水平的运动为这些未刺激的细胞（ 图2A和2B）。高度运动细胞[在我们的系统中，人巨细胞病毒（HCMV）感染的细胞]与此相反，其特征在于由作为细长的轨道区?...

讨论

轨道活力的phagokinetic在这篇文章中提出的分析是定量分析细胞迁移的一个简单而非常有效的方法。由于多种细胞类型可以分析^9-17，这种方法有可能跨越多个学科的广泛使用。胶体金镀膜玻璃盖玻片的使用允许测量由移动的小区的轨道区清零。该法可衡量的效果，不同的刺激（ 如生长因子，纯化的ECM配体，病毒，细菌）对细胞活力。此外，缺乏监测细胞迁移的要求，进行细胞固定，...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录号	评论
盖玻片（15毫米）	Fisher Scientific则	12-545-83
明胶300布鲁姆	Sigma-Aldrich公司	G-1890
四氯金酸三水合物	费舍尔化工	G54-1	14.5毫米（最终工作液）
柠檬酸钠	Fisher Scientific则	BP327-500	（最后工作溶液）0.5％
多聚甲醛	Fisher Scientific则	O4042	3％（最后工作溶液）
100毫米组织培养皿	萨尔斯塔特	83.1802
12孔板	Fisher Scientific则	08-772-29
24孔板	Fisher Scientific则	07-200-84
泰科的烤箱Hybridiser HB-1D	LabPlanet	2040500	标准的实验室烤箱就足够了
10毫升血清学移液管	萨尔斯塔特	86.1254.001
吸取援助灌装机/饮水机	德拉蒙德	13-681-15
P200单通道手动移液器	RAININ	PR-200
200毫升障碍提示	中电	BT200
ImageJ软件	HTTp :/ / rsb.info.nih.gov的/ IJ /		许可证：公共领域
尼康的Eclipse TE300一个配光CoolSNAPfx的单色12位的CCD相机	尼康		停产;最具可比性的规格有尼康的Eclipse钛，以及较低的尼康80I将是适当的。其他品牌也提供了类似的显微镜。
			注意：下面列出的试剂和设备已动用我们在我们的各种研究。其他供应品，供应商，试剂和设备都可以使用，只要他们有类似的规范。