Uma avaliação quantitativa da migração celular pelo ensaio Phagokinetic faixa Motilidade

Resumo

O ensaio de pista phagokinetic motilidade é um método utilizado para avaliar o movimento das células. Especificamente, o ensaio mede quimiocinese (motilidade celular aleatória) ao longo do tempo de uma forma quantitativa. O ensaio tira vantagem da capacidade das células para criar uma faixa mensurável do seu movimento em coloidais de ouro revestidas com lamelas.

Resumo

Motilidade celular é um processo biológico importante para ambos os organismos unicelulares e multicelulares. É essencial para o movimento de organismos unicelulares para uma fonte de nutrientes ou de distância a partir de condições inadequadas, bem como em organismos multicelulares para o desenvolvimento do tecido, a vigilância imunitária e cicatrização de feridas, apenas para mencionar alguns papéis ^1,2,3. Desregulação deste processo pode conduzir a graves doenças neurológicas, cardiovasculares e imunológicas, assim como a formação de tumores e exacerbada espalhar ^4,5. Molecularmente, actina de polimerização e reciclagem do receptor têm sido mostrados para desempenhar um papel importante na criação de extensões celulares (lamellipodia), que orientam o movimento para a frente da célula ^6,7,8. No entanto, muitas questões biológicas sobre a migração de células permanecem sem resposta.

O papel central para a motilidade celular na saúde humana e doenças sublinha a importância de compreender o mec específicahanisms envolvidos neste processo e torna os métodos precisos para avaliar a motilidade celular particularmente importante. Microscópios são geralmente usados ​​para visualizar o movimento das células. No entanto, as células se movem muito lentamente, fazendo a medição quantitativa da migração de células de um processo que consome recursos exigindo câmeras caras e software para criar quantitativos tempo decorrido filmes de células móveis. Portanto, a capacidade para realizar uma medição quantitativa da migração de células que é de custo eficaz, não-trabalhoso, e que utiliza equipamento de laboratório comum é uma grande necessidade de muitos investigadores.

O ensaio de motilidade phagokinetic faixa utiliza a capacidade de uma célula que se deslocam para limpar as partículas de ouro a partir do seu caminho para a criação de uma faixa mensurável sobre uma lamela de vidro revestido a ouro coloidal ^9,10. Com o uso de software disponível livremente, várias faixas podem ser avaliados para cada tratamento para realizar requisitos estatísticos. O ensaio pode ser utilizado para avaliarmotilidade de muitos tipos de células, tais como células cancerosas, ^11,12, fibroblastos, neutrófilos ^{9 13,} células do músculo esquelético, queratinócitos ^{14 15, 16} trofoblastos, células endoteliais e monócitos, ^{17 10,18-22.} O protocolo envolve a criação de lâminas revestidas com nanopartículas de ouro (Au °) que são gerados por uma redução de ácido cloroáurico (Au ^{3 +)} por citrato de sódio. Este método foi desenvolvido por Turkevich et al. Em 1951 ²³ e, em seguida, melhorado na década de 1970 por Frens et al. ^24,25. Como um resultado deste passo de redução química, as partículas de ouro (10-20 nm de diâmetro) precipitar a partir da mistura de reacção e pode ser aplicado a lamelas de vidro, os quais são, então, pronto para utilização em análises de migração celular ^9,26,27.

Em geral, o ensaio de motilidade phagokinetic pista é uma medida rápida, fácil e quantitativo da motilidade celular. Além disso, elepode ser utilizado como um ensaio de elevado débito simples, para ser utilizado com os tipos de células que não são passíveis de tempo caduco de imagem, assim como outras utilizações, dependendo das necessidades do investigador. Em conjunto, a capacidade de medir quantitativamente a motilidade celular de vários tipos de células, sem a necessidade de caros microscópios e software, bem como o uso de equipamento de laboratório comuns e produtos químicos, fazer o ensaio de motilidade phagokinetic faixa uma escolha sólida para cientistas com interesse na compreensão celular motilidade.

Protocolo

1. Preparação de gelatina revestidos Lamelas

1. Colocar o ácido-lavadas lamelas de vidro (15 mm de diâmetro) numa placa de plástico estéril milímetro 100 (ES). Coloque 8-9 lamínulas por placa e verifique se eles não estão tocando um ao outro ou os lados do prato ..

Nota: As lamelas, agulhas e pinças devem ser estéreis para eliminar possíveis microorganismos contaminantes, assim como endotoxinas, que irão afectar as funções celulares, incluindo a motilidade.

2. Pesa-se o pó de gelatina e ressuspender o pó em água desionizada para produzir uma solução de gelatina com uma concentração final de 0,5 g/300 ml. Em seguida, a solução de gelatina deve ser autoclavado.
3. Pipetar 2-3 gotas de gelatina (~ 100-150 ml) em cada lamela.

Nota: Tenha cuidado para não permitir que a gelatina para tocar o prato ou você não será capaz de remover as lamelas do prato.

4. Coza as lamelas revestidas com gelatina no prato de 100 mm em um forno a 90 ° C durante 10 min.
5. Retire o excesso de gelatina por pipetagem suave.
6. Secam-se as lamelas no prato de 100 mm, na estufa a 70 ° C durante 45 min.
7. Depois de seco, retire as lamelas do prato de 100 mm usando um estéril, agulha endotoxina livre e pinças (a agulha é usada para gentilmente cutucar a lamela para torná-lo acessível para a pinça para remover suavemente).
8. Coloque individuais de gelatina revestidos lamelas em poços separados de uma placa de 24 poços.

2. Preparação de ouro coloidal revestido Lamelas

1. Pesar uma quantidade apropriada de ácido cloroáurico (tri-hidrato de ácido tetracloroáurico; HAuCl ₄ · 3H ₂ O), e em seguida ressuspender em água desionizada estéril para preparar uma solução final de 14,5 mM (tóxico). Preparar 1,5 ml da solução por 8-9 lamelas.

Aviso: ácido cloroáurico é hbraçada se ingerido, causa queimaduras na pele e lesões oculares graves e pode provocar uma reação alérgica na pele. Tóxico se ingerido.

2. Pesar uma quantidade adequada de citrato de sódio (trissódico di-2-hidroxipropano-1 ,2,3-tricarboxilato; Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇₎ e, em seguida, voltar a suspender o pó em água desionizada para se obter uma solução final de 0,5%. Prepare 1 ml da solução por 8-9 lamelas.

Aviso: O citrato de sódio pode causar irritação dos olhos e da pele. Ele também pode causar irritação do trato respiratório e digestivo.

3. Em uma solução estéril, livre de endotoxinas proveta 1,5 ml de combinar a 14,5 mM estéril HAuCl solução ₄ e 13,5 mL de água desionizada estéril; o resultado deve originar uma solução amarelo pálido. Os volumes acima referidos irá permitir por 8-9 lamelas de ouro coloidal a serem feitas.
4. Enquanto agitando continuamente, aquecer a solução sobre uma placa quente até que comece a bóleo.

Aviso: O aquecimento da solução deve ser realizada no exaustor de fumos, como os vapores podem ser nocivos / tóxicos. Os vapores são destrutivas para o tecido das membranas mucosas e do trato respiratório superior.

5. Retirar o copo da placa de aquecimento.
6. Enquanto se agita, adicionar 0,7 ml da solução a 0,5% de citrato de sódio. O volume acima mencionado irá permitir por 8-9 lamelas de ouro coloidal a serem feitas.
7. Continue mexendo esta solução combinada de cerca de 2 min (Nota: A cor da solução irá gradualmente mudar de amarelo fraco, para limpar, a cinza, a púrpura, a púrpura de profundidade, antes de finalmente chegar a um vinho tinto ou, de preferência, ferrugem cor) . Este produto é a sua solução de ouro coloidal.
8. Arrefece-se a solução de ouro coloidal numa pipeta de 10 ml para 1-2 min (de modo a manter a camada de gelatina sobre a lamela de fusão, quando a solução de ouro coloidal é adicionada) e em seguida, adicionar 1,0-2,0 ml do colloidal solução de ouro em cada lamela de gelatina revestida previamente colocada em um prato de 24 cavidades (s) (a quantidade da solução de ouro coloidal, que adiciona as lamelas revestidas com gelatina depende de quão bem as partículas de ouro precipitou na solução - ver comentários abaixo).

Observação: Uma vez que pode haver variações na eficácia da precipitação de partículas de ouro, é aconselhável primeiro adicionar 0,5-1 ml da solução de ouro coloidal para as lamelas revestidas com gelatina e, em seguida, colocar o prato de 24 cavidades na incubadora durante 0,5 hr . Após este período de incubação, as lamelas devem ser verificadas sob o microscópio de luz para a densidade apropriada de partículas de ouro sobre as lamelas. Ver Figura 1 para a 20x de imagens de microscopia exemplos de muito baixa e uma concentração demasiado elevada de partículas de ouro. Ver Figura 2 para imagens de microscopia de 40x a concentração ideal de partículas de ouro (pelo menos para o uso com os monócitos). O optdensidade Imal das nanopartículas de ouro sobre a lâmina deve ser determinado experimentalmente para cada tipo de células utilizado, tal como as características das diferentes células vai ditar a sua força de movimento sobre as lamelas. Se a concentração de partículas de ouro é insuficiente, adicionar um ml 0,5-1 adicionais da solução de ouro coloidal para as lamelas revestidas com gelatina.

Dependendo do tamanho da célula, a concentração apropriada de partículas de ouro pode variar e, portanto, em última análise depende do tamanho da célula examinadas para a motilidade. Por exemplo, com monócitos humanos que são de tamanho pequeno de células (~ 10-20 uM ^28), uma maior concentração de partículas de ouro foi requerido na nossa análise. A distribuição apropriada de nanopartículas de ouro fornece o pesquisador, com a capacidade para facilmente e eficientemente distinguir as bordas de faixas celulares. A concentração de partículas de ouro que é demasiado elevado dificulta a capacidade das células para se mover e, por conseguinte, para medir com precisãosua motilidade, enquanto que uma concentração de partículas de ouro que é demasiado baixo para os limites de capacidade delinear uma faixa precisa de motilidade.

Nota importante: se a síntese de nanopartículas de ouro é problemática, nanopartículas de ouro sintetizados estão comercialmente disponíveis em tamanhos de 5 nm a 400 nm. Além disso, a microesferas fluorescentes também têm sido utilizadas em estudos da motilidade celular ^29. No entanto, o uso destas microesferas exige um microscópio fluorescente para a análise de migração celular.

9. Coloque o prato de 24 cavidades com o ouro coloidal-cobertas lamelas em uma incubadora a 37 ° C e incuba-se a partir de 1 hora até durante a noite.
10. Após a incubação, lavar / remover o ouro não ligado por imersão das lamelas (3x) em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS, pH 7,4).
11. Colocar estes coloidais de ouro revestidas com lamelas numa placa de 12 poços limpos (es) contendo PBS.
12. Armazenar estas lamelas a 4 ° C até estar pronto parausar (parafilme a placa antes de colocar no frigorífico).

Nota Importante: Sempre manter as coloidais revestidas de ouro lamínulas em algum tipo de líquido / mídia como as partículas de ouro pode descamar as lamelas de se secar. As lamelas de ouro coloidal deve ser usado dentro de 2-3 meses a partir da data em que foram feitas.

Controlo de Qualidade: Em um ensaio de motilidade phagokinetic única faixa, é crítica a utilização lamelas que são caracterizadas por uma concentração semelhante de partículas de ouro. Este ponto simples permitirá que as diferenças quantitativas na motilidade celular entre as amostras a ser unicamente devido a natureza do tratamento e não as propriedades físicas dos coloidais de ouro revestidas com lamelas. Nós favorecer a utilização de lamelas apenas feitos ao mesmo tempo em experiências individuais, embora tenhamos mostrado que, enquanto a densidade das nanopartículas de ouro são iguais, a utilização de lamelasa partir de diferentes preparações é apropriado.

3. Análise de Motilidade Celular

1. Colocar os coloidais de ouro revestidas com lamelas em meio apropriados celulares para as células de interesse.
2. Transferir as células tratadas apropriadamente para as coloidais de ouro revestidas com lamelas colocadas numa placa de 24 poços (es)

Nota: O número de células transferidas para o único poço tem de ser determinado para cada tipo de célula estudada. Idealmente, as células têm de ser distribuídos igualmente sobre a lamela de ouro coloidal revestido, que por sua vez vai permitir a análise estatística de faixas apenas criados por uma única célula. Se as células são plaqueadas a uma concentração demasiado elevada, torna-se altamente provável que as faixas sobrepostas de várias células pode ser vista. Faixas sobrepostas não podem ser quantificados com precisão e, por conseguinte, não podem ser tidos em conta nas análises finais do movimento das células testadas. Sobreposição faixas como resultado deo envolvimento de células múltiplas são geralmente facilmente observado, como fundidos ou cruzado faixas (no campo da análise), na qual duas ou mais células podem ser observados na área contígua mesma apagada.

3. Incubar a 37 ° CO C / 5% _2, durante 24 horas (ou durante qualquer momento adequado, por exemplo, nós analisamos a motilidade dos monócitos entre 6 hr e 24 hr células pós-tratamento e endoteliais a 12 hr pós-tratamento). O período de tempo óptimo para determinar e medir a motilidade celular irá variar com o tipo de célula estudada e, assim, deve ser determinado experimentalmente para cada tipo de célula (um bom ponto de partida, no entanto, é 6-12 tratamento pós-hr).

Nota: Se experimentais coloidais de ouro revestidas com lamelas têm de ser armazenados e / ou analisados ​​em um momento posterior, as células e nanopartículas de ouro devem ser fixados sobre as lamelas. Para realizar esta etapa de fixação; Passo seguinte 3.3, a primeira lavagem lamínulas cuidadosamente duas vezes com 1xPBS (imersão de lamelas é preferível, como uma remoção de nanopartículas de ouro a partir de lamelas devem ser evitados), em seguida, utilizar um método de fixação padrão de células, tal como a incubação com paraformaldeído à temperatura ambiente de 3%. Após uma incubação de 15 min, a 3% de paraformaldeído deve ser retirado e lavado cuidadosamente as lamelas 3 vezes com PBS 1x. As lamelas fixas podem ser armazenados num frigorífico.

4. Usando um microscópio de luz, capturar imagens das faixas criados por uma única célula em movimento (Nota: A ampliação usado para tirar fotografias de pistas celulares irão certamente variar dependendo do tipo de célula em estudo). Exemplos de pistas celulares criadas por células não-móveis e móveis sobre coloidais de ouro revestidas com lamelas são mostrados na Figura 2.

Nota: As nanopartículas de ouro do tamanho usado no ensaio phagokinetic faixa motilidade foi encontrado para ser totalmente não tóxico para as células ^30. Se necessário, A viabilidade das células analisadas pode ser avaliada por coloração com azul de tripano ou examinados para outros marcadores de viabilidade celular. Um teria que ter em conta a necessidade de um tipo de fixação, de fixação, etc, se este passo tem de ser realizada.

5. Usando o software livremente disponível, tal como o software ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) ou NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ), desenvolvidos no National Institutes of Health, ou ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ) desenvolvido na Universidade do Texas Health Science Center em San Antonio, a área média (em unidades arbitrárias) de ouro coloidal apuradas pela 10-20 ou mais células (por exemplo) é determinado para cada braço experimental a partir das imagens captadas. As estatísticas podem então ser realizadas em tele colecionou resultados. Por exemplo, os resultados podem ser representados como média ± o erro padrão das médias (SEM) com teste t de Student realizados, e um valor de P de <0,05 utilizadas como a medida de significância estatística entre as amostras. Figuras 3 e 4 passos mostram na análise da área de ouro coloidal apuradas pela célula.

Resultados

É mostrado um exemplo de imagens tomadas com um microscópio de luz, mostrando a área eliminada por via de uma única célula (a partir de monócitos nossas experiências é mostrado na Figura 2). As células não-móveis criar característica oval, pequeno ou em forma de círculo em torno de si tractos indicando um baixo nível basal de movimento para estas células não estimuladas (figuras 2A e 2B). Em contraste, as células altamente motile [no nosso sistema, o citomegalovírus hu...

Discussão

O ensaio de motilidade phagokinetic faixa apresentada neste artigo é um método simples e altamente eficaz para a análise quantitativa da migração celular. Porque vários tipos de células pode ser analisada ^9-17, este método tem o potencial de uso amplo em várias disciplinas. A utilização de lamelas de ouro coloidal revestido de vidro permite a medição de uma área de faixa, compensado por uma célula em movimento. O ensaio pode medir o efeito de diferentes estímulos (por exemplo, factore...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Lamelas de vidro (15 mm)	Fisher Scientific	12-545-83
Gelatina Bloom 300	Sigma-Aldrich	G-1890
Trihydrate Ácido tetracloroáurico	Fisher Chemical	G54-1	14,5 mM (uma solução de trabalho final)
Citrato de sódio	Fisher Scientific	BP327-500	0,5% (solução de trabalho final)
Paraformaldeído	Fisher Scientific	O4042	3% (de uma solução de trabalho final)
100 placas de cultura de tecidos milímetros	Sarstedt	83,1802
Placas de 12 poços	Fisher Scientific	08-772-29
Placas de 24 poços	Fisher Scientific	07-200-84
Forno Techne Hybridiser HB-1D	LabPlanet	2040500	O forno de laboratório padrão será suficiente
10 ml Pipetas sorológicas	Sarstedt	86.1254.001
Pipeta-Aid Filler / Dispenser	Drummond	13-681-15
P200 Single-Channel manual pipeta	Rainin	PR-200
200 ml de barreira Dicas	CLP	BT200
ImageJ software	http :/ / rsb.info.nih.gov / ij /		Licença: Domínio Público
Nikon Eclipse TE300 com um CoolSNAPfx Fotometria monocromático 12-bit câmera CCD	Nikon		Descontinuado; A especificação mais comparável tem Nikon Eclipse Ti, mas uma extremidade inferior Nikon 80i será apropriado também. Outras marcas também fornecer microscópios comparáveis.
			Nota: Os reagentes e equipamentos listados abaixo foram utilizados por nós em nossos vários estudos. Outras fontes, de fornecedores, reagentes e equipamentos que podem ser usados, contanto que elas têm especificações semelhantes.