Une évaluation quantitative de la migration cellulaire par le test de motilité piste Phagokinetic

Résumé

Le test de motilité phagokinetic piste est une méthode utilisée pour évaluer le mouvement des cellules. Plus précisément, le test mesure chimiokinèse (motilité cellulaire aléatoire) au fil du temps de manière quantitative. Le dosage tire parti de la capacité des cellules à créer une piste mesurable de leur mouvement sur colloïdales revêtues d'or lamelles.

Résumé

La motilité cellulaire est un processus biologique important pour les deux organismes unicellulaires et multicellulaires. Il est essentiel pour le mouvement des organismes unicellulaires vers une source de nutriments ou de loin des conditions inappropriées, ainsi que dans les organismes multicellulaires pour le développement des tissus, la surveillance immunitaire et la cicatrisation des plaies, pour n'en citer que quelques rôles ^1,2,3. La déréglementation de ce processus peut entraîner de graves maladies neurologiques, cardio-vasculaires et immunologiques, ainsi que exacerbé la formation de tumeurs et la propagation ^4,5. Moléculaire, polymérisation de l'actine et de recyclage des récepteurs ont été montré à jouer un rôle important dans la création d'extensions cellulaires (lamellipodes), qui animent le mouvement vers l'avant de la cellule ^6,7,8. Cependant, de nombreuses questions sur la migration des cellules biologiques restent sans réponse.

Le rôle central de la motilité cellulaire sur la santé humaine et la maladie souligne l'importance de comprendre le mec spécifiquehanisms impliqués dans ce processus et fait des méthodes précises d'évaluation de la motilité cellulaire particulièrement important. Microscopes sont généralement utilisés pour visualiser le mouvement des cellules. Cependant, les cellules se déplacent assez lentement, ce qui rend la mesure quantitative de la migration des cellules d'un processus consommateur de ressources nécessitant de coûteux appareils photographiques et des logiciels pour créer quantitatives temps périmé films de cellules mobiles. Par conséquent, la possibilité d'effectuer une mesure quantitative de la migration cellulaire qui est rentable, non-laborieux, et qui utilise l'équipement de laboratoire commun est une grande nécessité pour de nombreux chercheurs.

Le dosage piste phagokinetic motilité utilise la capacité d'une cellule mobile pour dégager des particules d'or de sa trajectoire pour créer une piste mesurable sur une lamelle de verre enduit d'or colloïdal, ^9,10. Avec l'utilisation de logiciels librement disponibles, plusieurs pistes peuvent être évalués pour chaque traitement pour accomplir les exigences statistiques. Le test peut être utilisé pour évaluermotilité de nombreux types de cellules, comme les cellules cancéreuses, ^11,12 fibroblastes ^{9, 13,} neutrophiles cellules musculaires squelettiques ^{14, 15,} kératinocytes trophoblastes ^16, les cellules endothéliales et les monocytes ^{17, 10,18-22.} Le protocole implique la création de lames recouvertes de nanoparticules d'or (Au ​​°) qui sont générés par une réduction de l'acide chloroaurique ⁽³ Au ⁺⁾ par le citrate de sodium. Cette méthode a été développée par Turkevich et al., En 1951 ^23, puis améliorée dans les années 1970 par Frens et al. ^24,25. À la suite de cette étape de réduction chimique, des particules d'or (10-20 nm de diamètre) précipiter à partir du mélange réactionnel et peuvent être appliqués à des lamelles de verre qui sont alors prêts à être utilisés dans des analyses de migration cellulaires ^9,26,27.

En général, le dosage piste phagokinetic motilité est une mesure rapide, quantitative et facile de la motilité cellulaire. En outre, ilpeut être utilisé comme un simple test à haut débit, pour une utilisation avec types de cellules qui ne se prêtent pas à temps caduc imagerie, ainsi que d'autres utilisations en fonction des besoins du chercheur. Ensemble, la capacité de mesurer quantitativement la motilité cellulaire de plusieurs types de cellules, sans la nécessité pour les microscopes coûteux et des logiciels, ainsi que l'utilisation de matériel de laboratoire et produits chimiques commun, faire l'essai de piste phagokinetic motilité un choix solide pour les scientifiques ayant un intérêt dans la compréhension cellulaire motilité.

Protocole

1. Préparation de gélatine à revêtement Lamelles

1. Placer les lamelles de verre lavées à l'acide (15 mm de diamètre) dans un plastique stérile boîte de 100 mm (es). Placer 8-9 lamelles par boîte et assurez-vous qu'ils ne se touchent pas les uns les autres ou sur les côtés du plat ..

Remarque: lamelles, les aiguilles et les pinces doivent être stérile pour éliminer les microorganismes contaminants possibles, ainsi que les endotoxines qui affectent les fonctions cellulaires, y compris la motilité.

2. Peser la poudre de gélatine et de remettre en suspension la poudre dans de l'eau désionisée pour former une solution de gélatine à une concentration finale de 0,5 g/300 ml. Ensuite, la solution de gélatine doit être autoclavé.
3. Pipette 2-3 gouttes de gélatine (~ 100-150 ml) sur chaque lamelle.

Remarque: Veillez à ne pas laisser la gélatine de toucher le plat ou vous ne serez pas en mesure de retirer les lamelles de la boîte.

4. Cuire les lamelles recouvertes de gélatine dans la boîte de 100 mm dans une étuve à 90 ° C pendant 10 min.
5. Enlever tout excès de gélatine par pipetage doux.
6. Sécher les lamelles dans le plat 100 mm dans le four à 70 ° C pendant 45 min.
7. Une fois sec, retirer les lamelles de la boîte de 100 mm en utilisant une solution stérile, sans endotoxine aiguille et pince à épiler (l'aiguille est utilisée pour pousser gentiment jusqu'à la lamelle à la rendre accessible à la pince à épiler pour enlever délicatement).
8. Placez individuelles revêtues de gélatine lamelles dans des puits séparés d'un plat de 24 puits.

2. Préparation de l'or colloïdal recouvertes de lamelles couvre-

1. Peser une quantité appropriée d'acide chloraurique (trihydrate d'acide tétrachloroaurique; HAuCl ₄ · 3H ₂ O), puis remettre en suspension dans de l'eau déminéralisée stérile pour préparer une solution finale 14,5 mM (toxique). Préparer 1,5 ml de la solution par 8-9 lamelles.

Attention: l'acide chloroaurique est hbrassée en cas d'ingestion cause des brûlures graves de la peau et des lésions oculaires et peut causer une réaction allergique cutanée. Toxique en cas d'ingestion.

2. Peser une quantité appropriée de citrate de sodium (dihydrogénophosphate trisodique 2-hydroxy-1 ,2,3-tricarboxylate; Na ₃ C ₆ H ₅ O _7), puis remise en suspension de la poudre dans de l'eau désionisée pour obtenir une solution finale à 0,5%. Préparer 1 ml de la solution par 8-9 lamelles.

Attention: le citrate de sodium peut irriter les yeux et la peau. Elle peut également causer une irritation des voies respiratoires et digestives.

3. Dans une solution stérile, sans endotoxines bécher combiner 1,5 ml de la solution stérile 14,5 mm _HAuCl4 solution et 13,5 ml d'eau déminéralisée stérile, le résultat devrait donner une solution jaune pâle. Les volumes mentionnés ci-dessus permettra pour 8-9 lamelles d'or colloïdal à faire.
4. Tout en continuant à agiter, chauffer la solution sur une plaque chaude jusqu'à ce qu'il commence à bhuile.

Avertissement: Le chauffage de la solution doit être effectuée sous la hotte, sous forme de vapeurs peut être nocif / toxique. Les vapeurs sont plus destructeur pour le tissu des muqueuses et des voies respiratoires supérieures.

5. Retirer le bécher de la plaque chauffante.
6. Tout en agitant, ajouter 0,7 ml de la solution de citrate de sodium à 0,5%. Le volume mentionné ci-dessus permettra pour 8-9 lamelles d'or colloïdal à faire.
7. Continuez à remuer cette solution combinée pendant environ 2 minutes (Note: La couleur de la solution change graduellement du jaune pâle, d'effacer, de gris, de violet, de pourpre foncé, avant d'atteindre finalement un vin rouge ou, de préférence, couleur rouille) . Ce produit est la solution d'or colloïdal.
8. Refroidir la solution d'or colloïdal dans une pipette de 10 ml de 1-2 min (pour garder la couche de gélatine sur la lamelle de fusion lorsque la solution d'or colloïdal est ajouté) et ensuite ajouter 1,0 à 2,0 ml de la colloidasolution d'or sur chaque lamelle l revêtues de gélatine préalablement placée dans un plat de 24 puits (s) (la quantité de la solution d'or colloïdal que vous ajoutez des lamelles recouvertes de gélatine dépend de la façon dont les particules d'or précipité dans la solution - voir commentaires ci-dessous).

Remarque: il peut y avoir des variations dans l'efficacité de la précipitation de particules d'or, il est conseillé de d'abord ajouter 0,5-1 ml de la solution d'or colloïdal pour les lamelles recouvertes de gélatine, puis placez le plat de 24 puits dans l'incubateur pendant 0,5 heure . Après ce temps d'incubation, les lamelles doivent être vérifiés au microscope optique de la densité appropriée des particules d'or sur les lamelles. Voir la figure 1 pour des images de microscopie de 20x exemples de trop faible et trop forte concentration de particules d'or. Voir la figure 2 pour des images de microscopie 40x d'une concentration idéale de particules d'or (au moins pour une utilisation avec des monocytes). L'optimal densité des nanoparticules d'or sur la lame doit être déterminée expérimentalement pour chaque type cellulaire utilisé, les caractéristiques des différentes cellules vont dicter leur force de mouvement sur les lamelles. Si la concentration de particules d'or est insuffisant, ajouter un supplément de 0,5-1 ml de la solution d'or colloïdal pour les lamelles recouvertes de gélatine.

En fonction de la taille des cellules, la concentration appropriée de particules d'or et peut varier, ce qui va finalement dépendre de la taille de la cellule examinée pour la motilité. Par exemple, avec des monocytes humains étant de petite taille des cellules (~ 10-20 um ^28), une plus forte concentration de particules d'or a été nécessaire dans nos analyses. La répartition appropriée des nanoparticules d'or fournit au chercheur la possibilité de facilement et efficacement distinguer les bords de pistes cellulaires. Une concentration de particules d'or qui est trop élevé nuit à la capacité des cellules à se déplacer et donc de mesurer avec précisionleur motilité, tandis que la concentration de particules d'or qui est trop faible limite les capacités de délimiter une plage précise de la motilité.

Note importante: Si la synthèse de nanoparticules d'or est problématique, des nanoparticules d'or synthétisées sont commercialement disponibles dans les tailles de 5 nm à 400 nm. En outre, des microsphères fluorescentes ont également été utilisés dans des études de ²⁹ motilité cellulaire. Toutefois, l'utilisation de ces microsphères nécessite un microscope à fluorescence pour l'analyse de la migration des cellules.

9. Placer le plat à 24 puits avec colloïdales d'or recouvertes de lamelles dans un incubateur à 37 ° C et incuber 1 h à partir du jour au lendemain.
10. Après l'incubation, rincer / extraire l'or non lié par trempage des lamelles (3x) en phosphate stérile (PBS, pH 7,4).
11. Placez ces colloïdales revêtues d'or lamelles dans un endroit propre et plat de 12 (es) contenant du PBS.
12. Conservez ces lamelles à 4 ° C jusqu'au moment deutiliser (parafilm la plaque avant de les placer dans un réfrigérateur).

Remarque importante: Toujours garder les colloïdales revêtues d'or lamelles dans un certain type de liquide / médias comme les particules d'or peuvent s'écailler des lamelles si on les laisse sécher. Les lamelles d'or colloïdal doit être utilisé dans les 2-3 mois à compter de la date à laquelle elles ont été faites.

Contrôle de la qualité: Dans un dosage unique piste phagokinetic motilité, il est essentiel d'utiliser des lamelles qui se caractérisent par une concentration analogue de particules d'or. Ce point simple permettra aux différences quantitatives dans la motilité cellulaire entre les échantillons d'être uniquement due à la nature du traitement et de ne pas les propriétés physiques des colloïdales revêtues d'or lamelles. Nous sommes favorables à l'utilisation des lamelles seulement faites en même temps dans des expériences individuelles, mais nous avons montré que, tant que la densité des nanoparticules d'or sont égaux, l'utilisation de lamellesà partir de différentes préparations est approprié.

3. L'analyse de la motilité cellulaire

1. Placer les colloïdes d'or revêtues de lamelles dans un milieu approprié cellulaires pour les cellules d'intérêt.
2. Transfert des cellules traitées de manière appropriée sur les colloïdales revêtues d'or lamelles placées dans un plat de 24 puits (s)

Remarque: Le nombre de cellules transférées au bien unique doit être déterminée pour chaque type cellulaire étudié. Idéalement, les cellules doivent être également répartis sur l'or colloïdal enduit de lamelle, qui à son tour permettra l'analyse statistique des seules traces créées par une seule cellule. Si les cellules sont étalées à une concentration trop élevée, il devient très probable que les pistes se chevauchent de plusieurs cellules on le verra. Pistes qui se chevauchent ne peuvent pas être quantifiés avec précision et, par conséquent, ils ne peuvent pas être pris en compte dans les analyses finales du mouvement des cellules testées. Chevauchement titres à la suite d'l'implication de plusieurs cellules sont généralement faciles à observer, comme la fusion ou croisement des routes (dans le domaine de l'analyse) dans lequel deux ou plusieurs cellules peuvent être observées dans la même zone contiguë effacé.

3. Incuber à 37 ° C CO / 5% ₂ pendant 24 heures (ou à toute heure convenable, par exemple, nous avons analysé la motilité des monocytes entre 6 h et 24 h cellules de post-traitement et endothéliales à 12 h post-traitement). Le délai optimal pour déterminer et mesurer la motilité cellulaire varie en fonction du type cellulaire étudié, et donc doit être déterminée expérimentalement pour chaque type de cellule (un bon point de départ, cependant, est de 6 à 12 heures après le traitement).

Remarque: Si expérimentales colloïdales revêtues d'or lamelles doivent être stockés et / ou analysées à un moment plus tard, les cellules et les nanoparticules d'or doivent être fixés sur les lamelles. Pour accomplir cette étape de fixation; Étape suivante 3.3, premier lavage des lamelles de soin 2 fois avec 1xPBS (trempage des lamelles est préférable, comme le retrait de nanoparticules d'or à partir des lamelles doit être évité), puis utiliser une méthode de fixation de cellules standard, telles que l'incubation avec du paraformaldéhyde température ambiante de 3%. Après une incubation de 15 min, le paraformaldéhyde 3% doivent être enlevés et les lamelles soigneusement lavés 3 fois avec du PBS 1x. Les lamelles fixes peuvent être stockés dans un réfrigérateur.

4. L'utilisation d'un microscope optique, capter des images des morceaux créés par une seule cellule mobile (Remarque: Le grossissement utilisé pour prendre des photos de pistes cellulaires vont certainement varier selon le type de cellule à l'étude). Des exemples de voies cellulaires créés par les cellules non-mobiles et immobiles sur colloïdales d'or revêtues de lamelles sont présentés dans la figure 2.

Remarque: Les nanoparticules d'or de la taille utilisée dans le test de motilité piste phagokinetic a été trouvé pour être complètement non toxique pour les cellules ^30. Si nécessaire, La viabilité des cellules examinées peut être évaluée par coloration au bleu trypan ou examinés pour d'autres marqueurs de la viabilité cellulaire. Il faudrait tenir compte de la nécessité pour la fixation, le type de fixation, etc, si cette étape doit être réalisée.

5. En utilisant le logiciel librement disponible, comme logiciel ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) ou NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ), développés à l' National Institutes of Health, ou ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ) développé à l'Université du Texas Health Science Center à San Antonio, la superficie moyenne (en unités arbitraires) de l'or colloïdal autorisé par 10-20 ou plusieurs cellules (par exemple) est déterminé pour chaque groupe expérimental à partir des images capturées. Les statistiques peuvent alors être exécutés sur til a recueilli les résultats. Par exemple, les résultats peuvent être tracées en moyenne ± l'erreur-type des moyens (SEM) avec des tests t de Student effectués, et une valeur de P <0,05 utilisés comme mesure de la signification statistique entre les échantillons. Figures 3 et 4 montrent des étapes de la analyse de la zone de l'or colloïdal dégagé par la cellule.

Résultats

Montré est un exemple de photos prises au microscope optique montrant une zone de piste effacée par une seule cellule (un monocyte de nos expériences est illustré à la figure 2). Cellules non-mobiles de créer typique de petite taille, de forme ovale ou un cercle en forme de tracts autour d'eux indiquant un faible niveau basal de mouvement de ces cellules non stimulées (Figures 2A et 2B). En revanche, les cellules très mobiles [dans notre système, le cytomégalovirus humain ...

Discussion

Le dosage de piste phagokinetic motilité présenté dans cet article est une méthode simple et très efficace pour l'analyse quantitative de la migration cellulaire. Parce que plusieurs types de cellules peuvent être analysées ^9-17, cette méthode présente l'utilisation vaste potentiel dans de multiples disciplines. L'utilisation de lamelles de verre colloïdales revêtues d'or permet la mesure d'une zone de route autorisée par une cellule mobile. Le test permet de mesurer l'effe...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lamelles de verre (15 mm)	Fisher Scientific	12-545-83
Gélatine 300 Bloom	Sigma-Aldrich	G-1890
Trihydrate d'acide tétrachloroaurique	Fisher Chemical	G54-1	14,5 mm (une solution de travail final)
Citrate de sodium	Fisher Scientific	BP327-500	0,5% (solution de travail final)
Paraformaldéhyde	Fisher Scientific	O4042	3% (solution de travail final)
Boîte de 100 mm Tissue Culture	Sarstedt	83.1802
Plaques de 12 puits	Fisher Scientific	08-772-29
Plaques à 24 puits	Fisher Scientific	07-200-84
Four Techne Hybridiser HB-1D	LabPlanet	2040500	Le four de laboratoire standard sera suffisant
10 pipettes sérologiques ml	Sarstedt	86.1254.001
Pipet-Aid de remplissage / Distributeur	Drummond	13-681-15
P200 Single-Channel Pipette manuelle	Rainin	PR-200
200 Filtres barrière ml	CLP	BT200
Logiciel ImageJ	http :/ / rsb.info.nih.gov / ij /		Licence: Public Domain
Nikon Eclipse TE300 avec un CoolSNAPfx photométriques monochrome 12-bit caméra CCD	Nikon		Discontinued; La spécification la plus comparable a Nikon Eclipse Ti, mais une extrémité inférieure Nikon 80i sera adapté aussi bien. Les autres marques également fournir des microscopes comparables.
			Remarque: Les réactifs et équipements énumérés ci-dessous ont été utilisés par nous dans nos différentes études. Autres fournitures, des fournisseurs, des réactifs et de l'équipement peut être utilisé, dans la mesure où ils ont des spécifications similaires.