Una evaluación cuantitativa de la migración celular mediante el ensayo de la canción Motilidad Phagokinetic

Resumen

El ensayo de motilidad phagokinetic track es un método usado para evaluar el movimiento de las células. Específicamente, el ensayo mide la quimiocinesis (motilidad celular aleatoria) en el tiempo de una manera cuantitativa. El ensayo se aprovecha de la capacidad de las células para crear una pista medible de su movimiento en coloidales de oro revestido con cubreobjetos.

Resumen

Motilidad celular es un proceso biológico importante para ambos organismos unicelulares y multicelulares. Es esencial para el movimiento de los organismos unicelulares hacia una fuente de nutrientes o fuera de las condiciones inadecuadas, así como en organismos multicelulares para desarrollo de tejidos, la vigilancia inmunológica y la cicatrización de heridas, sólo por mencionar algunos papeles ^1,2,3. La desregulación de este proceso puede conducir a graves enfermedades neurológicas, cardiovasculares e inmunológicos, así como la formación exacerbada tumor y diseminarse ^4,5. Molecularmente, la polimerización de actina y reciclado del receptor se ha demostrado que desempeñan papeles importantes en la creación de extensiones celulares (lamellipodia), que impulsan el movimiento de avance de la célula ^6,7,8. Sin embargo, muchas cuestiones biológicas acerca de la migración de células permanecen sin respuesta.

El papel central de la motilidad celular en la salud humana y la enfermedad pone de relieve la importancia de comprender el mec específicohanisms involucrados en este proceso y hace que los métodos precisos para la evaluación de la motilidad celular particularmente importante. Microscopios se utilizan generalmente para visualizar el movimiento de las células. Sin embargo, las células se mueven más lentamente, por lo que la medición cuantitativa de la migración de células de un proceso consume recursos que requieren costosas cámaras y software para crear cuantitativos Caducada tiempo películas de células móviles. Por lo tanto, la capacidad de realizar una medición cuantitativa de la migración celular que es rentable, no laborioso, y que utiliza el equipo común de laboratorio es una gran necesidad de muchos investigadores.

El ensayo de pista de la motilidad phagokinetic utiliza la capacidad de una célula en movimiento para eliminar partículas de oro de su camino para crear una pista medible sobre un cubreobjetos de vidrio revestida con oro coloidal ^9,10. Con el uso de software de libre disposición, múltiples pistas pueden ser evaluadas para cada tratamiento para lograr requisitos estadísticos. El ensayo puede ser utilizado para evaluarmotilidad de muchos tipos de células, tales como células de cáncer de ^11,12, fibroblastos, neutrófilos ^{9 13,} células del músculo esquelético, queratinocitos ^{14 15 16,} los trofoblastos, células endoteliales y monocitos ^{17, 10,18-22.} El protocolo implica la creación de diapositivas recubierto con nanopartículas de oro (Au °) que son generados por una reducción de ácido cloroaúrico (Au ^{3 +)} por citrato de sodio. Este método fue desarrollado por Turkevich et al. En 1951 ²³ y luego mejoró en los años 1970 por Frens et al. ^24,25. Como resultado de esta etapa de reducción química, partículas de oro (10-20 nm de diámetro) precipitar a partir de la mezcla de reacción y se puede aplicar a cubreobjetos de vidrio, que son entonces listo para su uso en los análisis de la migración celular ^9,26,27.

En general, el ensayo de motilidad phagokinetic track es una medida rápida, fácil y cuantitativa de la motilidad celular. Además, sepuede ser utilizado como un simple ensayo de alto rendimiento, para uso con tipos de células que no son susceptibles de tiempo-caducada formación de imágenes, así como otros usos, dependiendo de las necesidades del investigador. En conjunto, la capacidad para medir cuantitativamente la motilidad celular de múltiples tipos de células sin la necesidad de costosos microscopios y software, junto con el uso de equipo de laboratorio común y los productos químicos, hacer el ensayo de pista de la motilidad phagokinetic una buena elección para los científicos con un interés en comprender celular motilidad.

Protocolo

1. Preparación de gelatina cubreobjetos recubiertos

1. Coloque los lavados con ácido cubreobjetos de vidrio (15 mm de diámetro) en un plato de plástico estéril mm 100 (ES). Coloque 8-9 cubreobjetos por placa y asegurarse de que no se toquen entre sí o los lados del plato ..

Nota: cubreobjetos, agujas y pinzas necesitar ser estériles para eliminar posibles microorganismos contaminantes, así como endotoxinas que afectan las funciones celulares, incluyendo la motilidad.

2. Pesar el polvo de gelatina y resuspender el polvo en agua desionizada para preparar una solución de gelatina con una concentración final de 0,5 g/300 ml. A continuación, la solución de gelatina tiene que ser esterilizados en autoclave.
3. Pipetear 2-3 gotas de gelatina (~ 100-150 ml) a cada cubreobjetos.

Nota: Tenga cuidado de no permitir que la gelatina para tocar el plato o usted no será capaz de eliminar los cubreobjetos del plato.

4. Hornear los cubreobjetos recubiertos de gelatina en la placa de 100 mm en un horno a 90 ° C durante 10 min.
5. Quite el exceso de gelatina mediante pipeteo suave.
6. Secar los cubreobjetos en la placa de 100 mm en el horno a 70 º C durante 45 min.
7. Una vez seco, quite los cubreobjetos de la placa de 100 mm con una solución estéril, libre de endotoxinas aguja y pinzas (la aguja se utiliza para empujar suavemente el cubreobjetos para que sea accesible para las pinzas para quitar suavemente).
8. Coloque individuales recubiertos de gelatina cubreobjetos en pocillos separados de una placa de 24 pocillos.

2. Preparación de oro coloidal cubreobjetos recubiertos

1. Pesar una cantidad apropiada de ácido cloroaúrico (trihidrato de ácido tetracloroáurico; HAuCl ₄ · 3H ₂ O) y luego volver a suspender en agua desionizada estéril para preparar una solución final de 14,5 mM (tóxico). Preparar 1,5 ml de la solución por 8-9 cubreobjetos.

Advertencia: el ácido cloroaúrico es hbrazada si se ingiere, causa quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves y pueden causar una reacción alérgica en la piel. Tóxico en caso de ingestión.

2. Pesar una cantidad adecuada de citrato de sodio (trisódico dihidrógeno 2-hidroxipropano-1, 2,3-tricarboxilato; Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇₎ y luego volver a suspender el polvo en agua desionizada para obtener una solución final de 0,5%. Preparar 1 ml de la solución por 8-9 cubreobjetos.

Advertencia: el citrato de sodio puede causar irritación de ojos y piel. También puede causar irritación del tracto respiratorio y digestivo.

3. En una solución estéril, libre de endotoxina vaso de precipitados se combinan 1,5 ml de la estéril 14,5 mM HAuCl ₄ solución y 13,5 ml de agua desionizada estéril, y el resultado debe producir una solución de color amarillo pálido. Los volúmenes mencionados permitirá 8-9 cubreobjetos de oro coloidal que se harán.
4. Mientras continua la agitación, calentar la solución en una placa caliente hasta que comience a baceite.

Advertencia: El calentamiento de la solución se debe realizar en la campana de humos, como vapores puede ser dañino / tóxicos. Los vapores son destructivas para el tejido de las membranas mucosas y las vías respiratorias superiores.

5. Retirar el vaso de la placa caliente.
6. Mientras se agita, añadir 0,7 ml de la solución de citrato de sodio 0,5%. El volumen mencionado permitirá 8-9 cubreobjetos de oro coloidal que se harán.
7. Mantener la agitación esta solución combinada durante aproximadamente 2 min (Nota: el color de la solución cambia gradualmente de color amarillo pálido, para borrar, a gris, a púrpura, a púrpura oscuro, antes de llegar a un vino tinto o, preferiblemente, color herrumbre) . Este producto es la solución de oro coloidal.
8. Se enfría la solución de oro coloidal en una pipeta de 10 ml para 1-2 min (con el fin de mantener la capa de gelatina sobre el cubreobjetos de fusión cuando la solución de oro coloidal se añade) y luego añadir 1.0-2.0 ml de la colloidal de solución de oro sobre cada cubreobjetos recubiertos con gelatina previamente colocado en un plato de 24-pocillos (es) (la cantidad de la solución de oro coloidal que se agrega a los cubreobjetos recubiertos de gelatina depende de lo bien que las partículas de oro se precipita en la solución - véase comentarios a continuación.)

Nota: Debido a que puede haber variaciones en la eficiencia de la precipitación de partículas de oro, se aconseja añadir primero 0.5-1 ml de la solución de oro coloidal a los cubreobjetos recubiertos con gelatina y a continuación la cápsula 24-bien en la incubadora durante 0,5 hr . Después de este tiempo de incubación, los cubreobjetos se examinan bajo el microscopio de luz para la densidad adecuada de las partículas de oro sobre los cubreobjetos. Véase la Figura 1 para 20x imágenes de microscopía de ejemplos de demasiado bajo y demasiado alto una concentración de partículas de oro. Véase la Figura 2 para las imágenes de microscopía 40x de una concentración ideal de partículas de oro (al menos para uso con monocitos). El optimal densidad de las nanopartículas de oro en el portaobjetos debe ser determinado experimentalmente para cada tipo de células utilizadas, como las características de las diferentes células dictará su fuerza de movimiento en los cubreobjetos. Si la concentración de partículas de oro es insuficiente, agrega un adicional de 0.5-1 ml de la solución de oro coloidal a los cubreobjetos recubiertos con gelatina.

Dependiendo del tamaño de la célula, la concentración adecuada de partículas de oro pueden variar y, por lo tanto en última instancia dependerá del tamaño de la célula examinado para la motilidad. Por ejemplo, con los monocitos humanos que son de pequeño tamaño células (~ 10-20 micras ^28), una mayor concentración de partículas de oro se requería en nuestros análisis. La distribución adecuada de las nanopartículas de oro proporciona al investigador la capacidad de distinguir fácilmente y eficientemente los bordes de las pistas celulares. Una concentración de partículas de oro que es demasiado alta dificulta la capacidad de las células para moverse y por lo tanto para medir con precisiónsu motilidad, mientras que una concentración de partículas de oro que es demasiado bajo límites de capacidad de los de delinear un registro preciso de la motilidad.

Nota Importante: Si la síntesis de nanopartículas de oro es problemático, sintetizado nanopartículas de oro están disponibles comercialmente en tamaños desde 5 nm a 400 nm. Adicionalmente, microesferas fluorescentes también se han utilizado en estudios de motilidad de las células ^29. Sin embargo, el uso de estas microesferas requiere un microscopio de fluorescencia para el análisis de la migración celular.

9. Colocar el plato 24-así coloidales con cubreobjetos recubiertos de oro en una incubadora a 37 ° C e incubar entre 1 hr durante la noche.
10. Después de la incubación, enjuague / eliminar oro no unido por inmersión de los portaobjetos (3x) en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS, pH 7,4).
11. Coloque estos coloidales recubiertas de oro en un cubreobjetos limpio de 12 pocillos placa (s) que contiene PBS.
12. Almacenar estos cubreobjetos a 4 ° C hasta el momento deutilizar (Parafilm la placa antes de colocarlos en el refrigerador).

Nota importante: Siempre mantenga las coloidales recubiertas de oro cubreobjetos en algún tipo de líquido / medios de comunicación como las partículas de oro pueden desprenderse de los cubreobjetos si se deja secar. Los cubreobjetos de oro coloidal se debe utilizar dentro de 2-3 meses a partir de la fecha en que fueron hechas.

Control de calidad: En un solo ensayo phagokinetic motilidad pista, es crítico utilizar cubreobjetos que se caracterizan por una concentración similar de partículas de oro. Este punto simple permitirá a las diferencias cuantitativas en la motilidad celular entre las muestras a ser solamente debido a la naturaleza del tratamiento y no las propiedades físicas de las coloidales de oro revestido con cubreobjetos. Somos partidarios de cubreobjetos usando sólo realizadas al mismo tiempo en experimentos individuales, aunque se ha demostrado que siempre que la densidad de las nanopartículas de oro son iguales, el uso de cubreobjetosa partir de diferentes preparaciones es apropiado.

3. El análisis de la motilidad celular

1. Colocar las coloidales de oro revestido con cubreobjetos en un medio apropiado celulares para las células de interés.
2. Transferir las células tratadas adecuadamente sobre las coloidales de oro revestido con cubreobjetos colocados en una placa de 24-pocillos (es)

Nota: El número de células transferidas al pozo individual necesita ser determinado para cada tipo de célula estudiado. Idealmente, las células deben ser distribuidas por igual en el oro coloidal recubierto con cubreobjetos, que a su vez permitirá el análisis estadístico de las pistas sólo creado por una sola célula. Si las células se sembraron en placas a una concentración demasiado elevada, se vuelve altamente probable que las pistas superpuestas de células múltiples se verá. Pistas superpuestas no pueden cuantificarse con precisión y, por lo tanto, no pueden tenerse en cuenta en el análisis final del movimiento de las células de la prueba. Superposición de pistas como resultado dela participación de múltiples celdas generalmente son fáciles de observar, como fusionado o cruzado pistas (en el campo de análisis) en la que dos o más células pueden ser observados en la misma área contigua borra.

3. Incubar a 37 ° C / 5% de CO ₂ durante 24 horas (o para cualquier momento adecuado; por ejemplo, hemos analizado la motilidad monocitos entre 6 hr y 24 hr células post-tratamiento y endoteliales en 12 horas después del tratamiento). El marco de tiempo óptimo para determinar y medir la motilidad celular variará con el tipo de célula estudiado y, por lo tanto debe ser determinado experimentalmente para cada tipo de célula (un buen punto de partida, sin embargo, es 6 a 12 horas después del tratamiento).

Nota: Si experimentales coloidales de oro cubreobjetos recubiertos necesitan ser almacenados y / o analizados en un momento posterior, las células y nanopartículas de oro necesitan ser fijados sobre los cubreobjetos. Para llevar a cabo esta etapa de fijación; Paso siguiente 3.3, primer lavado cubreobjetos con cuidado 2 veces con 1xPBS (inmersión de cubreobjetos es preferible, como una eliminación de las nanopartículas de oro de cubreobjetos debe evitarse), a continuación, utilizar un método de fijación de células estándar, tal como la incubación con paraformaldehído al 3% a temperatura ambiente. Después de una incubación de 15-min, el paraformaldehído al 3% deben ser retirados y los cubreobjetos se lavaron cuidadosamente 3 veces con 1x PBS. Los cubreobjetos fijos se pueden almacenar en un refrigerador.

4. Utilizando un microscopio de luz, capturar imágenes de las pistas creadas por una sola célula en movimiento (Nota: El aumento que se usa para tomar fotografías de pistas celulares ciertamente variar en función del tipo de células bajo investigación). Ejemplos de pistas celulares creadas por las células no móviles y móviles sobre coloidales recubiertas de oro cubreobjetos se muestra en la Figura 2.

Nota: Las nanopartículas de oro de tamaño utilizado en el ensayo de motilidad pista phagokinetic se ha encontrado para ser completamente no tóxico para las células ^30. Si es necesario, La viabilidad de las células examinadas se puede evaluar por tinción con azul de tripano o examinar para otros marcadores de viabilidad celular. Habría que tener en cuenta la necesidad de fijación, tipo de fijación, etc, si este paso debe llevarse a cabo.

5. Usando el software libremente disponible, tales como el software ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) o NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ), ambos desarrollados en la Los Institutos Nacionales de la Salud, o ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ), desarrollado en la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio, el área promedio (en unidades arbitrarias) de oro coloidal aprobado por 10-20 o más células (por muestra) se determina para cada grupo experimental de las imágenes capturadas. Estadísticas entonces se puede realizar en tél recogió los resultados. Por ejemplo, los resultados pueden ser graficados como media ± el error estándar de la media (SEM) con t de Student pruebas realizadas, y un valor de p <0,05 se utilizan como medida de significación estadística entre las muestras. Las figuras 3 y 4 pasos muestran en la análisis de la zona de oro coloidal se aclaró por la célula.

Resultados

Se muestra un ejemplo de las imágenes tomadas con un microscopio óptico que muestra un área de la pista se aclaró por una sola célula (un monocito de nuestros experimentos se muestra en la Figura 2). No móviles células crean característica pequeño óvalo, o en forma de círculo alrededor de sí mismos-tractos que indican un bajo nivel basal de circulación de estas células no estimuladas (figuras 2A y 2B). En contraste, las células muy móviles [en nuestro sistema, el citomeg...

Discusión

El ensayo de la motilidad phagokinetic pista presentado en este artículo es un método simple y altamente eficaz para el análisis cuantitativo de la migración celular. Debido a múltiples tipos de células pueden ser analizados ^9-17, este método tiene el potencial de uso amplio en múltiples disciplinas. El uso de coloidales cubreobjetos de vidrio recubiertas de oro permite la medición de un área de la pista se aclaró por una célula en movimiento. El ensayo puede medir el efecto de diferentes estímul...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	El número de catálogo	Comentarios
Los cubreobjetos de vidrio (15 mm)	Fisher Scientific	12-545-83
La gelatina 300 Bloom	Sigma-Aldrich	G-1890
Trihidrato ácido tetracloroáurico	Fisher Chemical	G54-1	14,5 mM (una solución de trabajo final)
Citrato de Sodio	Fisher Scientific	BP327-500	0,5% (una solución de trabajo final)
Paraformaldehído	Fisher Scientific	O4042	3% (una solución de trabajo final)
100 mm placa de cultivo tisular	Sarstedt	83,1802
Placas de 12 pocillos	Fisher Scientific	08-772-29
Placas de 24 pocillos	Fisher Scientific	07-200-84
Techne Horno Hybridiser HB-1D	LabPlanet	2040500	El horno de laboratorio estándar será suficiente
10 ml Pipetas serológicas	Sarstedt	86.1254.001
Pipet-Aid Filler / Dispenser	Drummond	13-681-15
P200 Manual de un canal de pipeta	Rainin	PR-200
200 ml Consejos Barrera	CLP	BT200
ImageJ software	http :/ / rsb.info.nih.gov / ij /		Licencia: Dominio Público
Nikon Eclipse TE300 con un CoolSNAPfx fotométricas monocromo de 12-bit CCD cámara	Nikon		Discontinued; La especificación más comparable tiene Nikon Eclipse Ti, pero un extremo inferior Nikon 80i será adecuado también. Otras marcas también ofrecen microscopios comparables.
			Nota: Los reactivos y equipos que figuran a continuación han sido utilizados por nosotros en nuestros diversos estudios. Otros suministros, proveedores, reactivos y equipo puede utilizarse, siempre que tienen especificaciones similares.