Количественные оценки миграции клеток в Phagokinetic анализа подвижности трек

Резюме

Phagokinetic анализа трек подвижности является метод, используемый для оценки движения клеток. В частности, анализ мер хемокинез (случайный подвижность клеток) с течением времени в количественном выражении. Анализ использует способность клеток для создания измеримых отслеживать их движение на коллоидное золото покрытием покровные.

Аннотация

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles^1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread^4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell^6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.

The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.

The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip^9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells^11,12, fibroblasts⁹, neutrophils¹³, skeletal muscle cells¹⁴, keratinocytes¹⁵, trophoblasts¹⁶, endothelial cells¹⁷, and monocytes^10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au°) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au³⁺) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 1951²³ and then improved in the 1970s by Frens et al.^24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses^9,26,27.

In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

протокол

1. Подготовка желатин покрытием Покровные

1. Место кислотно-промытый покровные стекла (15 мм в диаметре) в стерильный пластиковый 100 мм блюдо (а). Поместите 8-9 покровных на блюдо и убедиться, что они не соприкасаются друг с другом или сторон блюдо ..

Примечание: Покровные стекла, иглы и пинцет должны быть стерильными, чтобы устранить возможные загрязнения микроорганизмами, а также эндотоксины, которые будут влиять клеточных функций, в том числе подвижности.

2. Взвешивание порошка желатина и ресуспендируют порошка в деионизованной воды, чтобы сделать раствор желатина с конечной концентрации 0,5 г/300 мл. Затем раствор желатина должно быть в автоклаве.
3. Пипетки 2-3 капли желатина (~ 100-150 мл) на каждую покровное.

Примечание: Будьте осторожны, чтобы не допустить желатин прикоснуться к блюду, или вы не сможете удалить покровные от тарелки.

4. Выпекать желатин покрытием покровные в 100 мм блюдо в духовке при температуре 90 ° С в течение 10 мин.
5. Удалите излишки желатина осторожным пипетированием.
6. Сухие покровные в 100 мм блюдо в духовке при температуре 70 ° C в течение 45 мин.
7. После высыхания, удалите покровные от 100 мм блюдо, используя стерильный, без эндотоксина иглы и пинцет (иглой, чтобы мягко подтолкнуть вверх покровное, чтобы сделать его доступным для пинцетом аккуратно удалить).
8. Поместите отдельные желатин покрытием покровные на отдельные лунки 24-луночных блюдо.

2. Подготовка коллоидного золота покрытием Покровные

1. Взвесьте необходимое количество chloroauric кислоты (tetrachloroauric тригидрат кислоты; HAuCl ₄ · 3H ₂ O), а затем ресуспендируют в стерильной деионизированной воды подготовить окончательный 14,5 мм раствор (токсичных). Подготовка 1,5 мл раствора на 8-9 покровные.

Внимание: Chloroauric кислота чохапку при проглатывании, вызывает сильные ожоги кожи и повреждения глаз и может вызвать аллергические реакции кожи. Токсичен при проглатывании.

2. Взвесьте необходимое количество цитрата натрия (тринатрия дигидрофосфат 2-гидроксипропан-1 ,2,3-tricarboxylate; Na ₃ C ₆ H ₅ O _7), а затем ресуспендируют порошка в деионизованной воды, чтобы сделать окончательные 0,5% раствора. Подготовить 1 мл раствора на 8-9 покровные.

Внимание: цитрат натрия может вызвать раздражение глаз и кожи. Это может также вызвать респираторные и желудочно-кишечного тракта раздражение.

3. В стерильные, без эндотоксина стакан сочетать 1,5 мл стерильного 14,5 мм HAuCl ₄ решения и 13,5 мл стерильной деионизированной воды; результат должны дать слабый раствор желтого цвета. Указанные объемы позволят за 8-9 коллоидного золота покровные быть сделано.
4. В то время как непрерывно помешивая, нагрейте раствор на горячей плите, пока она не начнет бнефти.

Внимание: нагревание раствора должна быть выполнена в вытяжном шкафу, так как пары могут быть вредными / токсичными. Пары оказывают разрушительное воздействие на ткани слизистых оболочек и верхних дыхательных путей.

5. Снимите стакан с горячей плите.
6. При перемешивании добавляют 0,7 мл 0,5% раствора цитрата натрия. Указанные объемы позволят за 8-9 коллоидного золота покровные быть сделано.
7. Продолжайте размешивать это универсальное решение для примерно 2 минуты (Примечание: цвет раствора будет постепенно меняться от бледно-желтого, очистить, до серого, до фиолетового, до темно-фиолетового, перед тем как достичь красного вина или, предпочтительно, ржавчины цвета) . Данный продукт является вашим коллоидный раствор золота.
8. Охладить коллоидный раствор золота в 10 мл пипетки в течение 1-2 мин (для того, чтобы сохранить желатиновый слой на покровное от таяния, когда коллоидный раствор золота добавляется), а затем добавить 1.0-2.0 мл colloidaл раствора на золото каждый желатин покрытием покровное ранее размещенных в 24-а блюдо (а) (сумма коллоидный раствор золота, которое вы добавляете в желатин покрытием покровные зависит от того, насколько хорошо частицы золота осаждается в растворе - см. комментарии ниже).

Примечание: Потому что там могут быть изменения в эффективности осаждения частиц золота, рекомендуется сначала добавить 0,5-1 мл коллоидного раствора золота в желатин покрытием покровные, а затем поместить 24-а блюдо в инкубаторе в течение 0,5 ч . После этого инкубационного периода, покровные должны быть проверены под световым микроскопом для соответствующей плотности частиц золота на покровные. См. рисунок 1 для 20x микроскопа изображений примеров слишком низко и слишком высокой концентрации частиц золота. См. Рисунок 2 для 40x изображений микроскопии идеальной концентрацией частиц золота (по крайней мере для использования с моноциты). ОПТмальные плотность наночастиц золота на слайде должны быть определены экспериментально для каждого типа клеток используются, как характеристики различных клеток будет диктовать свои силы движения на покровные. Если концентрация частиц золота недостаточно, добавить дополнительные 0,5-1 мл коллоидного раствора золота в желатин покрытием покровные.

В зависимости от размера ячейки, соответствующей концентрации частиц золота может меняться и, таким образом, в конечном счете, зависят от размера ячейки исследуют на подвижность. Например, в человеческих моноцитов быть малогабаритных клеток (~ 10-20 мкм ^28), более высокая концентрация частиц золота было необходимо в нашем анализе. Соответствующее распределение наночастиц золота предоставляет исследователю возможность легко и эффективно различать края сотовых треков. Концентрация частиц золота, которое является слишком высокой затрудняет способность клеток перемещаться и, следовательно, для точного измеренияих подвижности, в то время как концентрация частиц золота, которое является слишком низкие пределы способности человека определять точное трек подвижности.

Важное примечание: Если синтеза наночастиц золота является проблематичным, синтезированные наночастицы золота имеются в продаже в размерах от 5 нм до 400 нм. Кроме того, флуоресцентные микросферы были также использованы в исследованиях клеточной подвижности ^29. Тем не менее, использование этих микросфер требует флуоресцентный микроскоп для анализа миграции клеток.

9. Поместите 24-а блюдо с коллоидным золотом покрытые покровные в инкубаторе при температуре 37 ° C и инкубировать от 1 часа до ночи.
10. После инкубации промыть / удаления несвязанного золота путем погружения покровные (3x) в стерильные фосфатным буферным раствором (PBS, рН 7,4).
11. Поместите эти коллоидного золота покрытием покровные в чистую 12-а блюдо (ы), содержащий PBS.
12. Храните эти покровные при 4 ° С до готовностииспользовать (парафильмом пластины перед размещением в холодильнике).

Важное замечание: Всегда держите коллоидного золота покрытием покровные в некоторый тип жидкости / средства массовой информации, как частицы золота могут отслаиваться от покровных если дают высохнуть. Коллоидного золота покровные должны быть использованы в течение 2-3 месяцев с даты, когда они были сделаны.

Контроль качества: в одном phagokinetic анализа подвижности трек, очень важно использовать покровные, которые характеризуются аналогичной концентрации частиц золота. Эта простая точка позволит количественные различия в клеточной подвижности между образцами, чтобы быть исключительно из-за характера лечения, а не физическими свойствами коллоидного золота покрытием покровные. Мы выступаем с использованием только покровные сделаны в то же время в отдельных экспериментах, хотя мы показали, что до тех пор, как плотность наночастиц золота равны, использование покровныхот различных препаратов является целесообразным.

3. Анализ сотового Подвижность

1. Поместите коллоидного золота покрытием покровные в соответствующей сотовой СМИ для клеток интерес.
2. Передача надлежащее лечение клеток на коллоидное золото покрытием покровные помещают в 24-луночный блюдо (а)

Примечание: количество клеток передается в одной скважины должна быть определена для каждого типа клеток изучены. В идеале, клетки должны быть равномерно распределены по коллоидного золота покрытием покровное, которые в свою очередь позволят статистический анализ только треки, созданные на одну ячейку. Если Клетки высевали при слишком высокой концентрации, она становится весьма вероятным, что перекрытие следов нескольких ячеек будет видно. Перекрытие треков не может быть точно количественно и, таким образом, они не могут быть приняты во внимание в окончательном анализе движения проверенных клеток. Перекрытие треков в результатеучастие несколько ячеек, как правило, легко заметить, как объединить или пересек треков (в области анализа), в которых два или более клеток можно наблюдать в той же непрерывной очищенной области.

3. Инкубировать при 37 ° C / 5% CO ₂ в течение 24 ч (или на любое удобное время, например, мы проанализировали моноцитов подвижность между 6 ч и 24 ч после лечения и эндотелиальных клеток в 12 часа после лечения). Оптимальный срок для определения и измерения сотовой подвижность будет варьироваться в зависимости от типа клеток изучены и, таким образом, должны быть определены экспериментально для каждого типа клеток (хорошей отправной точкой, однако, 6 - 12 ч после обработки).

Примечание: Если экспериментальные коллоидного золота покрытием покровные должны храниться и / или проанализированы на более позднее время, клеток и наночастиц золота должны быть закреплены на покровные. Для достижения этой фиксации шаг, следующий шаг 3.3, первой стирки тщательно покровные 2 раза 1xPBS (погружение покровные предпочтительнее, так как удаление наночастиц золота из покровных следует избегать), а затем использовать стандартный метод фиксации клеток, таких как инкубации при комнатной температуре 3% параформальдегидом. После 15-минутной инкубации, 3% параформальдегидом должны быть удалены и покровные тщательно промывают 3 раза 1x PBS. Фиксированные покровные можно хранить в холодильнике.

4. С помощью светового микроскопа, захват изображения треки, созданные одной движущейся клетке (Примечание: увеличение используется для съемки сотовой треков, безусловно, варьироваться в зависимости от типа клеток под следствием). Примеры сотовой треки, созданные на неподвижных и подвижных клеток на коллоидное золото покрытием покровные показано на рисунке 2.

Примечание: наночастицы золота размером используемых в phagokinetic анализа подвижности трек был найден, чтобы быть полностью нетоксичны для клеток ^30. В случае необходимости, Жизнеспособность рассматриваемой клетки могут быть оценены путем окрашивания трипановым синим или рассматриваются другие маркеры клеточной жизнеспособности. Можно было бы принять во внимание необходимость для фиксации, тип фиксации, и т.д., если этот шаг необходимо проделать.

5. Использование свободно доступного программного обеспечения, таких как ImageJ программного обеспечения ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) или NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ), оба разработаны в Национальные Институты Здоровья, или ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ), разработанная в университете штата Техас здоровья Научного центра в Сан-Антонио, средняя площадь (в условных единицах) коллоидного золота очищается 10-20 или более ячеек (по образцу) определяется для каждой экспериментальной группе из захваченных изображений. Статистика может быть выполнена на тОн собрал результаты. Например, результаты могут быть нанесены как среднее ± стандартная ошибка средствами (SEM) с т тесты Студенческая выполняется, а значение P <0,05 использоваться как мера статистической значимости между образцами. Рисунках 3 и 4 показаны шаги в Анализ области коллоидное золото очищается клетки.

Результаты

Показанный пример фотографии, сделанные под световым микроскопом показывает трек область очищена одна ячейка (моноцитов из наших экспериментах показано на рисунке 2). Non-подвижных клеток создают характерный небольшие, овальной или круг формы участки вокруг себя указывает на ?...

Обсуждение

Phagokinetic анализа подвижности дорожки представленные в этой статье является простой и очень эффективный метод для количественного анализа миграции клеток. Потому что несколько типов клеток могут быть проанализированы ^9-17, этот метод имеет потенциал широкого использования несколь...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Покровные стекла (15 мм)	Fisher Scientific	12-545-83
Желатин 300 Bloom	Sigma-Aldrich	G-1890
Tetrachloroauric Trihydrate кислота	Фишер химической	G54-1	14,5 мм (окончательное решение рабочей)
Цитрат натрия	Fisher Scientific	BP327-500	0,5% (окончательное решение рабочей)
Параформальдегид	Fisher Scientific	O4042	3% (окончательное решение рабочей)
100 мм блюдо культуры ткани	Sarstedt	83,1802
12-луночные планшеты	Fisher Scientific	08-772-29
24-луночные планшеты	Fisher Scientific	07-200-84
Techne печь Hybridiser HB-1D	LabPlanet	2040500	Стандартные печи лаборатория будет достаточно
10 мл Пипетки серологические	Sarstedt	86.1254.001
Pipet-Aid Filler / диспенсер	Драммонд	13-681-15
P200 Single-Channel Руководство пипетки	Rainin	PR-200
200 советов мл Барьер	CLP	BT200
ImageJ программного обеспечения	HTTр :/ / rsb.info.nih.gov / ц /		Лицензия: Public Domain
Nikon Eclipse TE300 с Фотометрия CoolSNAPfx монохромный 12-битной CCD камеры	Nikon		Снято; наиболее сопоставимыми спецификации имеет Nikon Eclipse Ti, а нижний конец Nikon 80i будет подходящим, а также. Другие бренды также обеспечить сопоставимые микроскопов.
			Примечание: реагенты и оборудование, перечисленные ниже, были использованы нами в различных исследованиях. Другие материалы, поставщики, реактивы и оборудование можно использовать, пока они имеют сходные характеристики.