Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

要約

phagokinetic運動追跡アッセイは、細胞の動きを評価するために使用される方法です。具体的には、アッセイは、定量的な方法で時間をかけてケモキネシス（ランダム細胞の運動性）を測定します。アッセイは、コロイド金でコーティングされたカバースリップ上で彼らの動きの測定可能なトラックを作成する細胞の能力を活用しています。

要約

細胞の運動性は単細胞と多細胞生物の両方にとって重要な生物学的プロセスである。これは、ほんの数^1,2,3役割^に言及し、組織の発達、免疫監視および創傷治癒には不向きな条件からだけでなく、多細胞生物に離れて栄養源に向かって、または単細胞生物の動きのために不可欠です。このプロセスの規制緩和は重大な、神経、心血管および免疫疾患につながるだけでなく、腫瘍の形成と拡散^4,5を悪化させたことができます。分子、アクチンの重合と受容体のリサイクルは、セル^6,7,8の前方への移動を駆動する携帯電話の拡張（葉状仮足）の作成 ​​に重要な役割を果たすことが示されている。しかし、細胞の遊走についての多くの生物学的な疑問は未解決のままです。

ヒトの健​​康と疾患における細胞の運動性のための中心的な役割は、特定のMECを理解することの重要性を強調hanismsは、このプロセスに関与しており、特に重要な細胞の運動性を評価するための正確な方法になります。顕微鏡は、通常の細胞の動きを視覚化するために使用されています。しかし、細胞は運動性細胞の定量的な時間経過のムービーを作成するために高価なカメラとソフトウェアを必要とするリソースのかかるプロセスで細胞遊走の定量的な測定を行うことではなく、徐々に移動します。したがって、費用対効果が細胞移動の定量的な測定を実行する能力、非骨の折れる、共通実験装置を利用し、多くの研究者のための大きい必要があります。

phagokineticトラック運動性アッセイは、金コロイドで被覆されたガラスカバースリップ^9,10に測定可能なトラックを作成し、そのパスから金粒子をクリアする移動細胞の能力を利用しています。自由に利用できるソフトウェアを使用して、複数のトラックが統計的要件を達成するために、各治療のために評価することができます。アッセイは、評価するために利用することができがん細胞など多くの細胞型^、11,12、線維芽^9、好中球^13、骨格筋細胞^14、ケラチノサイト¹⁵トロホブラスト^16、内皮細胞^17、および単球の運動性^10,18-22。プロトコルは、クエン酸ナトリウムによって塩化金酸の還元金（Au ^{3 +）}によって生成された金ナノ粒子（金°）で被覆されたスライドの作成 ​​が含まれます。この方法は、1951年^23インチ Turkevich らによって開発された後、Frens らによって1970年代に改善された^。24,25。この化学還元工程の結果として、金粒子（直径10〜20 nm）は、反応混合物から沈殿させ、その後、細胞移動の解析^9,26,27で使用するための準備ができているカバーガラスに適用することができます。

一般的に、phagokineticトラック運動性アッセイは、細胞の運動性、迅速かつ簡単に定量的な尺度である。加えて、それ時間経過イメージング、ならびに研究者のニーズに応じて他の用途に適さない種類の細胞で使用するために、単純なハイスループットアッセイとして利用することができる。一緒に、定量的に高価な顕微鏡やソフトウェアを必要とせずに、複数の種類の細胞の細胞の運動性を測定する能力は、一般的な実験器具や薬品の使用とともに、phagokineticトラック運動分析セルラーを理解することに関心を持つ科学者のための堅実な選択肢作る運動性。

プロトコル

1。ゼラチンコートしたカバーガラスの作製

1. 滅菌したプラスチック製100 mmディッシュ（ES）の場所は、酸洗浄したカバーグラス（直径15ミリメートル）。皿あたり8から9カバーガラスを置き、彼らがお互いに触れたり、お皿の両側いないことを確認してください..

注：カバーガラス、針やピンセットは可能混入微生物、ならびに運動性を含む細胞機能に影響を与えるでしょうエンドトキシンを除去するために滅菌する必要があります。

2. ゼラチン粉末を秤量し、0.5 g/300 mlの最終濃度とゼラチン溶液を作るために、脱イオン水に粉体を懸濁します。次に、ゼラチン溶液は、オートクレーブ滅菌する必要があります。
3. 各カバースリップ上にゼラチンのピペット2〜3滴（〜100〜150ミリリットル）。

注：ゼラチンは皿に触れたり、皿からカバーガラスを削除することはできませんがないようにしてください。

4. 10分間90℃のオーブンで100 mmディッシュでゼラチンコートしたカバーガラスを焼く。
5. 穏やかにピペッティングすることによって過剰ゼラチンを削除します。
6. 45分間、70℃のオーブン中で100 mmディッシュ°Cでカバースリップを乾かします。
7. 一度乾燥、滅菌、エンドトキシンフリーの針とピンセット（針が優しく除去するために軽くピンセット用アクセスできるようにするためにカバースリップをナッジするために使用されます）を使用して100 mmディッシュからカバーガラスを削除します。
8. 24ウェル皿の別々のウェルに、個々のゼラチンコートしたカバーガラスを置きます。

2。金コロイドで被覆されたカバーガラスの作製

1. 塩化金酸（テトラクロロ金酸三水和物; HAuCl _{4·3H 2} O）の適切な量を計量してから、最後の14.5 mMの溶液（毒性）を調製し、無菌の脱イオン水に懸濁します。 8月9日カバースリップあたりの溶液1.5mlを準備します。

警告：塩化金酸はHであり、ひと抱え飲み込んだ場合は、重篤な皮膚の薬傷·眼の損傷を引き起こし、アレルギー性​​皮膚反応を引き起こす可能性があります。飲み込むと有毒。

2. クエン酸ナトリウム適量（三ナトリウム二水素2 -ヒドロキシ-1,2,3 -トリカルボン酸;のNa ₃ C ₆ H ₅ O _7）を計量し、その後、最終0.5％溶液を作るために脱イオン水に粉体を懸濁します。 8月9日カバースリップあたり溶液1mlを準備します。

警告：クエン酸ナトリウムは、目や皮膚に炎症を起こすことがあります。また、呼吸器や消化管の炎症を引き起こす可能性があります。

3. 滅菌、エンドトキシンフリーのビーカーに無菌14.5 mMのHAuCl ₄溶液および滅菌脱イオン水13.5ミリリットルの1.5ミリリットルを組み合わせ、その結果はかすかな黄色溶液が得られるはずです。前述のボリュームが作られている8月9日、金コロイドのカバーが可能になる。
4. 連続的に撹拌しながら、AがBに開始されるまで、ホットプレート上で溶液を加熱オイル。

警告：蒸気は毒性/害を及ぼす可能性があるとして、溶液の加熱は、ドラフト内で行うべきである。蒸気は粘膜及び上気道の組織に破壊的である。

5. ホットプレートからビーカーを取り出します。
6. 撹拌しながら、0.5％クエン酸ナトリウム溶液0.7 mlを加える。前述のボリュームが作られている8月9日、金コロイドのカバーが可能になる。
7. 約2分間、この統合されたソリューションを撹拌しておく（注：溶液の色が徐々に最終的に赤ワインに到達する前に、深い紫色に、紫色、灰色に、クリアまたは、好ましくは、さび色に、淡い黄色から変更されます） 。本製品は、金コロイド溶液である。
8. 1〜2分（金コロイド溶液が追加されたときに融解カバースリップ上にゼラチン層を維持するために）のために10ミリリットルピペット内の金コロイド溶液を冷却してからcolloidaの1.0〜2.0ミリリットルを追加以前に24ウェルディッシュ（ES）に置かれ、各ゼラチン被覆カバーガラス上にlの金溶液（あなたはゼラチンコートしたカバーガラスに追加した金コロイド溶液の量は、金粒子が溶液中に沈殿どれだけに依存する - を参照してください下のコメント欄）。

注：金粒子の析出効率の変動があるかもしれないので、それが最初にゼラチンコートしたカバーガラスに金コロイド溶液0.5〜1 mlを加え、その後0.5時間インキュベーター内で24ウェル皿を置くことをお勧めします。このインキュベーション時間後、カバーはカバースリップ上の金粒子の適切な密度のために、光学顕微鏡下でチェックする必要があります。金粒子の低すぎるとあまりにも高濃度の例の20倍の顕微鏡写真を図1を参照してください。金粒子の理想的な濃度の40倍の顕微鏡画像（少なくとも単球と使用）については、 図2を参照してください。オプトインスライド上の金ナノ粒子のimal密度は、実験的に異なる細胞の特性はカバースリップ上に運動の強さが決まりますので、使用される各細胞型のために決定されるべきである。金粒子の濃度が不足している場合は、ゼラチンコートしたカバーガラスに金コロイド溶液の追加0.5〜1ミリリットルを追加します。

セルの大きさに応じて、金粒子の適切な濃度は変わることができると、このように最終的に運動性を検討し、セルのサイズに依存します。例えば、ヒト単球は小型の細胞（10月20日^〜28ミクロン）であることと、金粒子の高い濃度は我々の分析では必須であった。金ナノ粒子の適切な配分を簡単かつ効率的に細胞のトラックのエッジを区別する能力を持つ研究者を提供しています。高すぎると、金粒子の濃度が正確に測定することが移動するとする細胞の能力を妨げる値が低すぎるものが運動能力の正確な軌道を描くことである金粒子の濃度はしばらくその運動、。

重要な注意：金ナノ粒子の合成に問題がある場合には、合成された金ナノ粒子が5〜400nmのサイズで市販されている。さらに、蛍光ミクロスフェアは、細胞の運動性²⁹の研究にも使用されてきた。しかし、これらの微小球の使用は、細胞遊走の分析のための蛍光顕微鏡を必要とします。

9. 37℃インキュベーター中のコロイド金で覆われたカバーグラスで24ウェル皿を置き、1時間から一晩℃にインキュベートする。
10. インキュベーション後、リンス/（PBS; pH7.4）で緩衝化生理食塩水、滅菌リン酸にカバースリップ（3X）を浸漬することによって結合していない金を削除します。
11. PBSを含むクリーンな12ウェルディッシュ（es）は、これらのコロイド金でコーティングされたカバーガラスを置きます。
12. 4℃まで、これらのカバーガラスを格納する準備（パラフィルム冷蔵庫に置く前板）を使用します。

重要な注意：金粒子がカバーガラスから剥がれ落ち、できるだけ乾燥させた場合は、常に液体/メディアのいくつかのタイプに金コロイドコーティングしたカバースリップを保つ。金コロイドのカバーは、それらが作られた日付2から3ヶ月以内にご使用ください。

品質管理：単一phagokineticトラック運動アッセイでは、それは金粒子の同様の濃度によって特徴付けられるカバーグラスを使用することが重要です。この簡単なポイントは、治療ではなく、金コロイドコーティングしたカバーガラスの物理的性質の性質のみに起因するサンプル間の細胞運動性の定量的な違いを考慮するでしょう。我々は、金ナノ粒子の密度がある限りが等しいことが示されているが、我々は、個々の実験で同時に作られる唯一のカバーガラスを使用して好む、カバーガラスの使用異なる調製物から適切である。

3。細胞運動性の解析

1. 目的の細胞に適した細胞の培地中でコロイド金でコーティングされたカバーガラスを置きます。
2. 24ウェルディッシュ（ES）に置かれた金コロイドコーティングしたカバーガラス上に適切に処理された細胞を転送

注：単一のウェルに移した細胞の数は、各細胞型が研究のために決定する必要があります。理想的には、細胞が均等に順番に単一のセルで作成されたトラックのみの統計的分析を可能とする金コロイドコーティングしたカバースリップ上で配布する必要があります。細胞があまりにも高濃度で播種している場合は、複数のセルの重複トラックが見られる可能性が高いことになります。重複トラックを正確に定量することはできませんし、従って、それらはテストされた細胞の動きの最終解析において考慮することができません。の結果として、トラックを重複複数のセルの関与は通常容易に観察される、2つ以上のセルが同じ連続クリアされた領域で観察することができる合併または交差トラック（分析の分野で）。

3. 37℃で24時間のためのC / 5％CO _2（または任意の適切な時間のために、我々は6時間と12時間の後処理で24時間、後処理と内皮細胞との間で単球の運動性を解析した例を参照 ）。細胞型が研究し、こうして実験的に各細胞型（ - 12時間の治療後の良い出発点は、しかし、6である）のために決定されるべきであると細胞運動性を決定し、測定するための最適な時間枠は異なります。

注：実験コロイド金でコーティングされたカバースリップを後で保存および/ ​​または分析する必要がある場合、セルと金ナノ粒子は、カバーガラス上に固定する必要があります。この固定ステップを達成するために、以下のステップ3.3、最初の洗浄は1xで慎重に2回カバースリップPBSは（カバーガラスから金ナノ粒子の除去は避けなければならないようにカバーガラスを浸漬することが好ましい）、そのような室温3％パラホルムアルデヒドとのインキュベーションなどの標準的な細胞固定法を使用します。 15分間インキュベートした後、3％パラホルムアルデヒドを除去する必要があり、カバーガラスは、1x PBSで注意深く3回洗浄した。固定されたカバースリップを冷蔵庫に保存することができます。

4. 光学顕微鏡を使用して、単一の可動セル（：確かに、調査中の細胞のタイプによって異なります携帯トラックの写真を撮るために使用される倍率注）によって作成されたトラックの画像をキャプチャします。コロイド金でコーティングされたカバースリップ上で非運動性と運動性の細胞によって作成された携帯電話のトラックの例を図2に示します。

注：phagokineticトラック運動性アッセイで使用されるサイズの金ナノ粒子はセル³⁰に対して完全に無毒であることが判明している。必要に応じて、調べた細胞の生存率はトリパンブルーで染色することによって評価または細胞生存の他のマーカーを調べることができます。一つは、このステップが実施する必要がある場合は、アカウントに固定等の固定、型の必要性を取らなければならないだろう。

5. ImageJのようなソフトウェア（自由に利用できるソフトウェア、使い方http://rsbweb.nih.gov/ij/ ）またはNIHイメージ（ http://rsb.info.nih.gov/nih-image/で開発）、両方を米国立衛生研究所（NIH）、またはImageToolを（ http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.htmlは ）サンアントニオのテキサス健康科学センターによりクリアコロイド金の平均面積（任意の単位）の大学で開発された10から20以上のセル（サンプルあたり）撮影した画像から、各実験群のために決定される。統計情報は、トンでも実行でき彼は結果を収集した。たとえば、結果は平均±スチューデント実行t検定 、および< のP値のサンプル間の統計的有意性の尺度として使用さ0.05の平均値の標準誤差（SEM）としてプロットすることができます。 図3および図4のステップは、セルでクリアコロイド金の面積の分析。

結果

示されている単一電池（我々の実験から単球を図2に示されている）によってクリアトラック領域を示す光学顕微鏡下で撮影した画像の一例です。非運動性の細胞は、特徴的な、小さな楕円形またはこれらの刺激細胞（ 図2Aおよび2B）のための運動の低い基底レベルを示す自身の周りに円形の管を作成します。これとは対照的に、非常に運動性の細胞[私た...

ディスカッション

この記事で紹介phagokineticトラック運動性アッセイは、細胞遊走の定量分析のためのシンプルで非常に効果的な方法です。複数の細胞型が^9月17日を分析することができるので、この方法は、複数の分野にまたがる広範な潜在的な用法を持っています。コロイド金コートしたカバーガラスの使用は、移動セルでクリアトラック領域の測定が可能になる。アッセイは、細胞の運動性で異な?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	注釈
カバーガラス（15ミリメートル）	フィッシャー·サイエンティフィック	12-545-83
ゼラチン300ブルーム	シグマアルドリッチ	G-1890
テトラクロロ金酸三水和物	フィッシャーケミカル	G54-1	14.5ミリメートル（最終作業溶液）
クエン酸ナトリウム	フィッシャー·サイエンティフィック	BP327-500	0.5％（最終的な作業溶液）
パラホルムアルデヒド	フィッシャー·サイエンティフィック	O4042	3％（最終的な作業溶液）
100mmの組織培養皿	ザルスタット	83.1802
12ウェルプレート	フィッシャー·サイエンティフィック	08-772-29
24ウェルプレート	フィッシャー·サイエンティフィック	07-200-84
テクネオーブンHybridiser HB-1D	LabPlanet	2040500	標準的な実験室のオーブンで十分でしょう
10ミリリットル血清ピペット	ザルスタット	86.1254.001
ピペットエイドフィラー/ディスペンサー	ドラモンド	13-681-15
P200シングルチャンネルピペットマニュアル	レイニン	PR-200
200ミリリットルバリアのヒント	CLP	BT200
ImageJのソフトウェア	HTTP :/ / rsb.info.nih.gov / IJ /		ライセンス：パブリックドメイン
photometrics CoolSNAPfxニコンエクリプスTE300は、12ビットCCDカメラをモノクロ	ニコン		中止、ほとんど匹敵する仕様は、ニコンエクリプスTiを持っていますが、下端ニコン80Iも適しています。他のブランドも匹敵する顕微鏡を提供する。
			注：下記の試薬 ​​および機器は私たちの様々な研究で我々が利用されてきた。その他の消耗品サプライヤー、試薬、機器がある限り、彼らは同様の仕様を持っているとして、使用することができます。