Eine quantitative Auswertung der Zellmigration durch die Phagokinetic Spur Motilität Assay

Zusammenfassung

Die Motilität phagokinetic Spur Assay ist ein Verfahren verwendet, um die Bewegung von Zellen beurteilen. Insbesondere misst der Test Chemokinese (random Zellmotilität) über die Zeit in einer quantitativen Weise. Der Assay nutzt die Fähigkeit von Zellen, um eine messbare Spur ihrer Bewegung auf kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern erstellen.

Zusammenfassung

Cellular Motilität ist ein wichtiger biologischer Prozess für beide einzelligen und mehrzelligen Organismen. Es ist wichtig für die Bewegung der einzelligen Organismen zu einer Quelle von Nährstoffen oder weg von ungeeigneten Bedingungen, als auch in vielzelligen Organismen für Tissue Entwicklung, Immunüberwachung und Wundheilung, nur um ein paar Rollen ^1,2,3 erwähnen. Deregulierung dieses Prozesses kann zu schweren neurologischen, Herz-Kreislauf-und immunologischen Erkrankungen, sowie verschärfte Tumorbildung führen und zu verbreiten ^4,5. Molekular sind Aktin-Polymerisation und Rezeptor-Recycling erwiesen wichtige Rollen bei der Schaffung zellulären Verlängerungen (Lamellipodien), die die Vorwärtsbewegung der Zelle ^6,7,8 anzutreiben spielen. Allerdings bleiben viele biologische Fragen zu Zellmigration unbeantwortet.

Die zentrale Rolle für die zelluläre Motilität menschlicher Gesundheit und Erkrankungen unterstreicht die Bedeutung des Verständnisses der spezifischen mechanisms an diesem Prozess beteiligt und macht genaue Methoden zur Bewertung Zellmotilität besonders wichtig. Mikroskope werden üblicherweise verwendet, um die Bewegung von Zellen visualisieren. Allerdings bewegen Zellen eher langsam, so dass die quantitative Messung der Zellmigration eine Ressource langwieriger Prozess erfordern teure Kameras und Software, um quantitative Zeitraffer Filme von beweglichen Zellen zu schaffen. Daher ist die Fähigkeit, eine quantitative Messung der Zellmigration, die kostengünstige, nicht mühsam, und daß nutzt gemeinsamen Laborgeräten ist ausführen ein großer Bedarf für viele Forscher.

Die Spur phagokinetic Motilität Assay nutzt die Fähigkeit einer Zelle zu bewegenden Goldpartikel aus seiner Bahn zu löschen, um eine Spur auf einer messbaren kolloidalem Gold beschichteten Deckgläschen ^9,10 erstellen. Mit dem Einsatz von frei verfügbarer Software, können mehrere Spuren für jede Behandlung, die statistischen Anforderungen erfüllen ausgewertet werden. Der Assay kann verwendet werden, um zu beurteilenMotilität von vielen Zelltypen, wie Krebszellen ^11,12, Fibroblasten ^9, Neutrophilen ^13, Skelettmuskelzellen ^14, Keratinozyten ^15, Trophoblasten ^{16, 17} Endothelzellen und Monozyten ^10,18-22. Das Protokoll beinhaltet die Erzeugung von Folien mit Gold-Nanopartikeln (Au °), die durch eine Reduktion von Chlorgoldsäure (Au ^{3 +)} durch Natriumcitrat erzeugt beschichtet sind. Diese Methode wurde von Turkevich et al. Im Jahr 1951 ²³ und dann verbesserte sich in den 1970er Jahren von Frens et al. ^24,25. Als Ergebnis dieser chemischen Reduktionsschritt auszufällen Goldpartikel (10 bis 20 nm Durchmesser) aus der Reaktionsmischung und kann auf Deckgläschen, die dann bereit für die Verwendung in Zellwanderung Analysen ^9,26,27 aufgebracht werden.

Im Allgemeinen ist die Spur phagokinetic Motilität Assay eine schnelle, quantitative und einfache Maßnahme zellulärer Motilität. Darüber hinaus ist eskann als einfache Hochdurchsatz-Assay verwendet werden, zur Verwendung mit Zelltypen, die nicht zugänglich sind Zeitraffer Bildgebung, sowie andere Anwendungen in Abhängigkeit von den Bedürfnissen der Forscher. Zusammen, die Fähigkeit, quantitativ zu messen zellulären Motilität von mehreren Zelltypen, ohne die Notwendigkeit für teure Mikroskope und Software, zusammen mit der Verwendung von gemeinsamen Laborgeräte und Chemikalien machen den phagokinetic Spur Motilität Assay eine gute Wahl für die Wissenschaftler mit einem Interesse für das Verständnis zellulärer Motilität.

Protokoll

Ein. Herstellung von Gelatine-beschichtete Deckgläser

1. Ort acid-washed Deckgläschen (15 mm Durchmesser) in einem sterilen 100-mm-Schale (n). Zeigen 8-9 Deckgläser pro Gericht und sicherzustellen, dass sie nicht gegenseitig berühren oder die Seiten der Schüssel ..

Anmerkung: Die Deckgläser, Nadeln und Pinzette müssen steril sein, um mögliche kontaminierenden Mikroorganismen sowie Endotoxine, die zellulären Funktionen, einschließlich Motilität beeinflussen eliminieren.

2. Wiegen die Gelatinepulver und resuspendieren des Pulvers in entionisiertem Wasser auf eine Gelatine-Lösung mit einer Endkonzentration von 0,5 g/300 ml betrug. Weiter muss die Gelatinelösung zur autoklaviert werden.
3. Pipette 2-3 Tropfen Gelatine (~ 100-150 ml) auf jedes Deckglas.

Hinweis: Achten Sie darauf, nicht zu erlauben, die Gelatine in die Schale berühren oder Sie werden nicht in der Lage, die Deckgläser aus der Schale entfernen.

4. Backen die Gelatine-beschichtete Deckgläser in der 100-mm-Schale in einem Ofen bei 90 ° C für 10 min.
5. Entfernen Sie das überschüssige Gelatine durch vorsichtiges Pipettieren.
6. Trockne die Deckgläser in der 100-mm-Schale in dem Ofen bei 70 ° C für 45 min.
7. Einmal trocken, entfernen Sie die Deckgläser aus der 100-mm-Schale mit einer sterilen, Endotoxin-freie Nadel und Pinzette (die Nadel wird verwendet, um vorsichtig anzustossen das Deckglas zugänglich zu machen für die Pinzette vorsichtig entfernen).
8. Platzieren einzelner Gelatine beschichtete Deckgläser in separate Vertiefungen einer 24-Well-Platte.

2. Herstellung von kolloidalem Gold beschichteten Deckgläschen

1. Wiegen eine entsprechende Menge an Chlorogoldsäure (Tetrachlorogoldsäure Trihydrat; HAuCl ₄ · 3H ₂ O) und dann in sterilem deionisiertem Wasser suspendieren, um eine endgültige 14,5 mM Lösung (giftig) vorzubereiten. Planen 1,5 ml der Lösung pro 8-9 Deckgläsern.

Warning: Chlorogoldsäure ist harmful bei Verschlucken bewirkt schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden und kann allergische Hautreaktionen verursachen. Giftig beim Verschlucken.

2. Wiegen einer geeigneten Menge Natriumcitrat (Trinatrium dihydrogen 2-hydroxypropan-1 ,2,3-tricarboxylat; Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇₎ und dann das Pulver resuspendieren in entionisiertem Wasser, um eine endgültige 0,5% ige Lösung herzustellen. Planen 1 ml der Lösung pro 8-9 Deckgläsern.

Warning: Natriumcitrat kann Augen und Haut reizen. Es kann auch die Atemwege und den Verdauungstrakt reizen.

3. In einer sterilen, Endotoxin-frei kombinieren Becherglas 1,5 ml des sterilen 14,5 mM HAuCl _4-Lösung und 13,5 ml sterilem, deionisiertem Wasser, das Ergebnis sollte eine schwach gelbe Lösung erhalten wurde. Die oben genannten Mengen werden für 8-9 kolloidalem Gold Deckgläser gemacht werden können.
4. Unter ständigem Rühren erhitzt, die Lösung auf einer heißen Platte, bis sie zu b beginntÖl.

Warnung: Die Erwärmung der Lösung sollte im Abzug durchgeführt werden, als Dämpfe schädlich sein kann / giftig. Die Dämpfe sind schädlich für das Gewebe der Schleimhäute und oberen Atemwege.

5. Entfernen Sie das Becherglas von der Heizplatte.
6. Unter Rühren hinzufügen, 0,7 ml der 0,5% Natriumcitrat-Lösung. Die oben erwähnte Volumen wird für 8-9 kolloidalem Gold Deckgläser gemacht werden können.
7. Halten Sie das Rühren diese kombinierte Lösung für ca. 2 min (Hinweis: Die Farbe der Lösung wird allmählich von schwachen gelben verändern, zu löschen, zu grau, zu lila, Deep Purple, bevor sie schließlich erreichte einen Rotwein oder vorzugsweise Rostfarbe) . Dieses Produkt ist Ihr kolloidalem Gold Lösung.
8. Man kühlt die kolloidale Goldlösung in einer 10 ml Pipette für 1-2 min (in der Reihenfolge, um die Gelatine-Schicht auf dem Deckglas aus Schmelzen zu halten, wenn die kolloidale Goldlösung hinzugefügt wird) und dann Hinzufügen von 1,0 bis 2,0 ml der colloidal Gold Lösung auf jede mit Gelatine beschichteten Deckgläschen zuvor in einer 24-Well-Platte (n) (die Menge der kolloidalen Goldlösung, dass sie zu den Gelatine-beschichtete Deckgläser hinzuzufügen abhängig, wie gut die Goldpartikel präzipitiert in der Lösung angeordnet - siehe Anmerkungen unten).

Hinweis: Da es Unterschiede in der Effizienz der Goldpartikel Niederschläge sein könnte, ist es ratsam, zuerst hinzufügen 0,5-1 ml von kolloidalem Gold Lösung der Gelatine-beschichteten Deckgläsern und dann die 24-Well-Platte in den Inkubator für 0,5 h . Nach dieser Inkubationszeit sollten die Deckgläser unter dem Lichtmikroskop auf die entsprechende Dichte der Goldpartikel auf den Deckgläschen überprüft werden. Siehe Abbildung 1 für 20x Mikroskopiebilder von Beispielen zu niedrig und eine zu hohe Konzentration von Goldpartikeln. Siehe Abbildung 2 für 40x Mikroskopiebilder eines idealen Konzentration von Goldpartikeln (mindestens für die Verwendung mit Monozyten). Die optimal Dichte der Goldnanopartikel auf der Folie sollte experimentell für jeden Zelltyp bestimmt werden, da die Eigenschaften der verschiedenen Zellen ihre Festigkeit Bewegung auf den Deckgläschen diktieren. Wenn die Konzentration von Goldpartikeln unzureichend ist, eine zusätzliche 0,5-1 ml des kolloidalen Goldlösung den Gelatine-beschichtete Deckgläser.

Abhängig von der Größe der Zellen, können die entsprechenden Konzentrationen von Goldpartikeln variieren und damit letztlich von der Größe der Zelle für Motilität untersucht abhängen. Beispielsweise mit humanen Monozyten wobei klein bemessenen Zellen (~ 10-20 um ²⁸⁾ wurde eine höhere Konzentration von Goldpartikeln in die Analysen benötigt. Die geeignete Verteilung von Goldnanopartikeln stellt dem Forscher die Fähigkeit, leicht und effizient Unterscheidung der Kanten der zellulären Spuren. Eine Konzentration von Goldpartikeln, die zu hoch ist behindert die Fähigkeit von Zellen zu bewegen und somit die genaue Messungihre Beweglichkeit, während eine Konzentration von Goldpartikeln, die zu niedrig Grenzen eine Fähigkeit, einen genauen Überblick über Motilität abzugrenzen ist.

Wichtiger Hinweis: Wenn die Synthese von Gold-Nanopartikeln ist problematisch sind synthetisiert Gold-Nanopartikeln kommerziell erhältlich in den Größen von 5 nm bis 400 nm auf. Zusätzlich haben fluoreszierenden Mikrosphären auch in Studien der Zellmotilität ²⁹ verwendet worden. Jedoch erfordert die Verwendung dieser Mikrokugeln eines Fluoreszenzmikroskops für die Analyse der Zellmigration.

9. Legen Sie die 24-Well-Platte mit kolloidalem Gold bedeckten Deckgläschen in einem Brutschrank bei 37 ° C und inkubieren von 1 h bis über Nacht.
10. Nach Inkubation spülen / Entfernen ungebundenen Gold durch Eintauchen der Deckgläser (3x) in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4).
11. Legen Sie diese kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern in einem sauberen 12-Well-Platte (n) mit PBS.
12. Bewahren Sie diese Deckgläser bei 4 ° C bis zumverwenden (Parafilm die Platte, bevor sie in einem Kühlschrank).

Wichtiger Hinweis: Halten Sie die kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern in irgendeine Art von Flüssigkeit / Medien als die Goldpartikel kann abplatzen von den Deckgläsern, wenn trocknen gelassen. Die kolloidalem Gold Deckgläser sollte innerhalb von 2-3 Monaten ab dem Zeitpunkt, als sie getätigt wurden verwendet werden.

Qualitätskontrolle: In einer einzigen Spur phagokinetic Motilität Assay, ist es kritisch, Deckgläschen, die durch eine ähnliche Konzentration von Goldpartikeln gekennzeichnet verwenden. Diese einfache Punkt wird für die quantitativen Unterschiede im zellulären Motilität zwischen Proben zu ermöglichen, allein aufgrund der Art der Behandlung und nicht die physikalischen Eigenschaften der kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern. Wir bevorzugen Verwendung nur Deckgläser gleichzeitig in einzelnen Versuche gemacht, obwohl wir gezeigt, dass, solange die Dichte der Goldnanopartikel gleich sind haben, die Verwendung von Deckgläsernaus verschiedenen Präparate geeignet ist.

3. Analyse zellulärer Motilität

1. Platzieren Sie die Goldkolloid-beschichtete Deckgläser in einem geeigneten zellulären für die Zellen von Interesse.
2. Übertragen entsprechend behandelten Zellen auf die kolloidale Gold-beschichteten Deckgläschen in einer 24-Well-Platte (n) platziert

Anmerkung: Die Anzahl von Zellen transferiert zum Einzelwell muss bestimmt für jeden Zelltyp studiert werden. Idealerweise sollten Zellen gleichmäßig auf der kolloidalem Gold beschichteten Deckgläschen, die wiederum für die statistische Analyse von nur Spuren von einer einzigen Zelle erstellt ermöglichen verteilt werden. Wenn Zellen mit zu hoher Konzentration plattiert sind, wird es sehr wahrscheinlich, dass überlappende Spuren mehrerer Zellen gesehen wird. Überlappenden Spuren nicht genau quantifiziert werden, und somit können sie keine Berücksichtigung in der endgültigen Analyse der Bewegung der getesteten Zellen aufgenommen werden. Überlappenden Spuren durchdie Einbeziehung mehrerer Zellen werden üblicherweise leicht beobachtet; als fusionierte oder Spuren (im Bereich der Analyse), in der zwei oder mehr Zellen in der gleichen angrenzenden freigemachten Fläche beobachtet werden kann gekreuzt.

3. Bei 37 ° C / 5% CO ₂ für 24 Stunden (oder aus einem geeigneten Zeitpunkt, zB Monozyten wir Motilität analysierten zwischen 6 h ​​und 24 h nach der Behandlung und Endothelzellen nach 12 h nach der Behandlung). Die optimale Zeitspanne zur Bestimmung und Messung zelluläre Motilität variieren mit dem Zelltyp untersucht und somit sollte experimentell für jeden Zelltyp (ein guter Ausgangspunkt jedoch beträgt 6 - 12 Stunden nach Behandlung) bestimmt werden.

Anmerkung: Wenn experimentellen kolloidalem Gold beschichteten Deckgläschen zu speichernden und / oder zu einem späteren Zeitpunkt analysiert, benötigen die Zellen und Gold-Nanopartikel auf die Deckgläser fixiert werden. Um diese Fixierung Schritt zu erreichen; folgenden Schritt 3,3, Deckgläser ersten Waschen sorgfältig 2 mal mit 1xPBS (Eintauchen Deckgläser ist vorzuziehen, da eine Entnahme von Gold-Nanopartikeln aus Deckgläser müssen vermieden werden), dann verwenden Sie ein Standard Zellfixierung Methode, wie Inkubation mit Raumtemperatur 3% Paraformaldehyd. Nach einer 15-minütigen Inkubation sollte die 3% Paraformaldehyd entfernt werden und die Deckgläser sorgfältig gewaschen 3 mal mit PBS 1x. Die festen Deckgläser in einem Kühlschrank aufbewahrt werden.

4. Verwendung eines Lichtmikroskops, die Aufnahmen der Schienen von einem einzigen beweglichen Zelle (Anmerkung: Die Vergrößerung verwendet werden, Bilder von zellulären Spuren sicher ergreifen je nach Zelltyp zu untersuchenden) erstellt. Beispiele für zelluläre Titel von unbeweglichen und beweglichen Zellen auf kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern erstellt sind in Abbildung 2 gezeigt.

Anmerkung: Die Gold-Nanoteilchen von der Größe in der Spur phagokinetic Motilität Assay verwendet wurde gefunden, daß völlig ungiftig für Zellen ^30. NotfallsKann die Lebensfähigkeit der untersuchten Zellen durch Anfärben mit Trypanblau beurteilt oder geprüft für andere Marker der zellulären Lebensfähigkeit. Man müsste berücksichtigt die Notwendigkeit für die Fixierung, die Art der Fixierung, etc., wenn dieser Schritt muss durchgeführt werden.

5. Mit der frei verfügbaren Software, wie ImageJ Software ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) oder NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ), beide an der Entwicklung National Institutes of Health, oder ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ) an der University of Texas Health Science Center in San Antonio, die durchschnittliche Fläche (in willkürlichen Einheiten) von kolloidalem Gold gelöscht entwickelt von 10-20 oder mehr Zellen (pro Probe) wird für jeden experimentellen Arm aus den aufgenommenen Bildern bestimmt. Statistiken können dann auf t durchgeführt werdener sammelte Ergebnisse. Zum Beispiel können die Ergebnisse aufgetragen als Mittel werden ± Standardfehler des Mittels (SEM) mit dem Student-t-Tests durchgeführt, und einem P-Wert <0,05 als Maß der statistische Signifikanz zwischen Proben verwendet. Abbildungen 3 und 4 zeigen Schritte in der Analyse des Bereichs von kolloidalem Gold durch die Zelle gelöscht.

Ergebnisse

Ist ein Beispiel der Bilder unter einem Lichtmikroskop, die einen Gleisbereich durch eine einzige Zelle (a Monozyt aus unseren Experimenten ist in Abbildung 2 gezeigt) gelöscht entnommen. Unbeweglichen Zellen zu schaffen charakteristischen kleinen, ovalen oder kreisförmigen Bahnen um sich herum, die einen niedrigen Grundniveau der Bewegung für diesen stimulierten Zellen (2A und 2B). Im Gegensatz dazu sind hoch beweglichen Zellen [in unserem System, humanen Cytomegalovirus (HCMV)-infi...

Diskussion

Die phagokinetic Spur Motilität Assay in diesem Artikel vorgestellt ist eine einfache und sehr effektive Methode zur quantitativen Analyse von Zellmigration. Da mehrere Zelltypen ^9-17 analysiert werden kann, hat diese Methode das Potenzial breiten Einsatz über mehrere Disziplinen. Die Verwendung von kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern erlaubt die Messung einer Gleisbereich durch einen sich bewegenden Zelle gelöscht. Der Assay kann den Effekt verschiedener Stimuli (zB Wachstumsfaktoren, Lig...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalognummer	Kommentare
Deckgläschen (15 mm)	Fisher Scientific	12-545-83
Gelatine 300 Bloom	Sigma-Aldrich	G-1890
Tetrachlorogoldsäure Trihydrate	Fisher Chemical	G54-1	14,5 mM (a Endbearbeitung Lösung)
Sodium Citrate	Fisher Scientific	BP327-500	0,5% (a Endbearbeitung Lösung)
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	O4042	3% (a Endbearbeitung Lösung)
100 mm Gewebekulturschale	Sarstedt	83,1802
12-Well-Platten	Fisher Scientific	08-772-29
24-Well-Platten	Fisher Scientific	07-200-84
Techne Backofen Hybridiser HB-1D	LabPlanet	2040500	Der Standard Laborofen genügt
10 ml Serologische Pipetten	Sarstedt	86.1254.001
Pipet-Aid Filler / Dispenser	Drummond	13-681-15
P200 Single-Channel Manuelle Pipette	Rainin	PR-200
200 ml Barrier Tips	CLP	BT200
ImageJ Software	http :/ / rsb.info.nih.gov / ij /		Lizenz: Public Domain
Nikon Eclipse TE300 mit einem photometrics CoolSNAPfx monochrom 12-Bit-CCD-Kamera	Nikon		Eingestellt; Die meisten vergleichbaren Spezifikation hat Nikon Eclipse Ti, aber ein unteres Ende Nikon 80i wird ebenso geeignet. Andere Marken bieten auch vergleichbare Mikroskope.
			Hinweis: Die Reagenzien und Geräte unten aufgeführten wurden von uns in unseren verschiedenen Studien eingesetzt. Andere Lieferungen, Lieferanten, Reagenzien und Geräte können verwendet werden, solange sie ähnliche Spezifikationen haben.