הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

Summary

Assay מסלול תנועתיות phagokinetic הוא שיטה המשמשת כדי להעריך את התנועה של תאים. באופן ספציפי, assay מודד chemokinesis (תנועתיות תאים האקראיות) לאורך הזמן באופן כמותי. Assay מנצל את יכולתם של תאים ליצור מסלול למדידת התנועה שלהם על coverslips colloidal מצופה זהב.

Abstract

תנועתיות ניידות היא תהליך ביולוגי חשוב לשני יצורים חד תאיים ורבים תאיים. הוא חיוני לתנועה של יצורים חד תאיים לכיוון מקור של חומרים מזינים או במרחק שאינם מתאימים תנאים, כמו גם באורגניזמים תאיים לפיתוח רקמות, מעקב חיסוני וריפוי פצעים, רק כדי להזכיר כמה תפקידים ^1,2,3. הסרת פיקוח על תהליך זה יכול להוביל למחלות קשות נוירולוגיות, לב וכלי דם ומערכת חיסון, כמו גם היווצרות גידול החמיר והתפשטה ^4,5. מולקולרי, פילמור יקטין ומחזור הקולט הוכחו לשחק תפקיד חשוב ביצירת רחבות סלולריות (lamellipodia), המניעות את התנועה קדימה בתא ^6,7,8. עם זאת, שאלות רבות ביולוגיות על נדידת תאים נותרו ללא מענה.

התפקיד המרכזי לתנועתיות סלולרית באדם מחל בריאות מדגיש את החשיבות של הבנת MEC הספציפיhanisms מעורב בתהליך הזה והופך את השיטות מדויקות להערכת תנועתיות תא חשובה במיוחד. מיקרוסקופים משמשים בדרך כלל כדי לחזות את התנועה של תאים. עם זאת, תאים לנוע די לאט, מה שהופך את מדידת כמותית של נדידת תאי תהליך גוזל משאבים דורשים מצלמות ותוכנה יקרות כדי ליצור סרטים כמותיים נושנים של תאים ניעתי. לכן, היכולת לבצע מדידת כמותית של נדידת תאים שהיא יעיל וחסכוני, שאינם מייגע, ושמנצל ציוד מעבדה משותף היא צורך גדול עבור חוקרים רבים.

בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic מנצלת את יכולתו של תא נע כדי לנקות חלקיקי זהב ממסלולו כדי ליצור מסלול מדיד על coverslip זכוכית מצופת הזהב colloidal ^9,10. עם השימוש בתוכנה זמינה באופן חופשי, מספר רבים של מסלולים ניתן להעריך עבור כל טיפול כדי להשיג את הצורכים סטטיסטיים. הבדיקה יכולה להיות מנוצלת כדי להעריךתנועתיות של תאים מסוגים רבים, כגון תאים סרטניים, ^11,12 פיברובלסטים ^9, נויטרופילים ^13, תאי שריר שלד ^{14, 15,} הקרטינוציטים trophoblasts ^{16, 17,} תאי האנדותל ומונוציטים ^10,18-22. הפרוטוקול כולל יצירת שקופיות מצופות בחלקיקי זהב (° Au) המופקים על ידי הפחתה של חומצת chloroauric ⁽³ Au ⁺⁾ על ידי ציטרט הנתרן. שיטה זו פותחה על ידי Turkevich et al. בשנת 1951 ²³ ולאחר מכן השתפרה בשנתי ה -1970 על ידי Frens et al. ^24,25. כתוצאה מהפחתת צעד זה כימי, חלקיקי זהב (10-20 ננומטר בקוטר) יזרזו מתערובת התגובה ויכולים להיות מיושמים על coverslips זכוכית, אשר אז מוכנים לשימוש בניתוחי נדידה סלולריות ^9,26,27.

באופן כללי, בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic היא מדד מהיר, כמותית וקלה של תנועתיות סלולרית. בנוסף,יכול להיות מנוצל כמו assay פשוט תפוקה גבוהה, לשימוש עם סוגי תאים שאינם ניתן להדמיה נושנה, כמו גם שימושים אחרים, בהתאם לצרכימים של החוקר. ביחד, את היכולת למדידת כמותית תנועתיות סלולריות של סוגי תאים מרובים ללא צורך במיקרוסקופים ותוכנה יקרים, יחד עם השימוש בציוד מעבדה משותף וכימיקלים, לבצע בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic בחירה מוצקה למדענים בעלי עניין בהבנה סלולרית תנועתיות.

Protocol

1. הכנת Coverslips ג'לטין המצופה

1. מקום coverslips חומצה שטף את הכוס (15 מ"מ קוטר) בצלחת סטרילית פלסטיק 100 מ"מ (ES). הנח 8-9 coverslips לצלחת ולוודא שהם לא נוגעים זה בזה או את הצדדים של הצלחת ..

הערה: Coverslips, מחטים ומלקטים צריכות להיות סטרילי לחסל מיקרואורגניזמים אפשריים מזהמים, כמו גם endotoxins שישפיע על תפקודים תאיים, כולל תנועתיות.

2. לשקול את אבקת הג'לטין וresuspend את האבקה במי deionized לעשות פתרון ג'לטין עם ריכוז סופי של 0.5 g/300 מ"ל. בשלב בא, פתרון ג'לטין צריך להיות autoclaved.
3. פיפטה 2-3 טיפין של ג'לטין (~ 100-150 מ"ל) על כל coverslip.

הערה: היזהר שלא לאפשר את הג'לטין לגעת תבשיל או שלא יהיה מסוגל להסיר את coverslips מהצלחת.

>
4. אופה את coverslips ג'לטין המצופה בצלחת 100 מ"מימ בתנור בטמפרטורת 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
5. הסר ג'לטין העודף על ידי pipetting העדין.
6. ייבש את coverslips בצלחת 100 מ"מימ בתנור בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
7. ברגע יבש, להסיר את coverslips מצלחת 100 מ"מימ באמצעות מחט סטרילית, נטולת אנדוטוקסין ופינצטה (מחט משמש בעדינות על מנת לקרב את coverslip כדי להפוך אותו לנגיש לפינצטה בעדינות להסיר).
8. הנח coverslips הבודד ג'לטין מצופה לתוך בארות נפרדות של 24 מנה טובה.

2. הכנת Coverslips קולואידיות מצופית זהב

1. שוקל כמות מתאימה של חומצת chloroauric (trihydrate החומצה tetrachloroauric; HAuCl ₄ · 3H ₂ O) ולאחר מכן במי resuspend deionized סטרילי כדי להכין פתרון סופי 14.5 מ"מ (רעיל). הכן 1.5 מ"ל של הפתרון ל8-9 coverslips.

אזהרה: חומצת Chloroauric היא hמלוא חופנים בבליעה, יוצר כוויות קשות ולניזק לעיניים ועלול לגרום לתגובה אלרגית בעור. רעילה בבליעה.

2. שוקל כמות מתאימה של ציטרט הנתרן (Trisodium dihydrogen 2-hydroxypropane-1-,2,3 tricarboxylate; Na ₃ C ₆ H _{5 7} O) ולאחר מכן resuspend את האבקה במי deionized לעשות פתרון סופי 0.5%. הכן 1 מ"ל של הפתרון ל8-9 coverslips.

אזהרה: ציטראט נתרן עלול לגרום לעין וגירוי בעור. היא עשויה גם לגרום לגירוי בדרך נשימה ועיכול.

3. במבחנה סטרילית, נטולת אנדוטוקסין לשלב 1.5 מ"ל של התמיסה סטרילית ₄ 14.5 מ"מ HAuCl ו -13.5 מיליליטר מי deionized סטרילית, והתוצאה אמורה להניב פתרון צהוב קלוש. את הכרכים הנ"ל ייאפשרו ל8-9 coverslips הזהב colloidal להתבצע.
4. בעוד ברציפות ערבוב, מחמם את התמיסה על פלטה חמה עד שהוא מתחיל בשמן.

אזהרה: החימום של הפתרון צריך להתבצע במנדף, כמו אדים יכולים להיות מזיקים / רעילים. האדים הם הרסניים לרקמות של הריריות ודרכי נשימה העליונה.

5. הסר את הכוס מהפלטה החמה.
6. תוך כדי ערבוב, להוסיף 0.7 מ"ל של 0.5% פתרון ציטרט הנתרן. ההיקף האמור יאפשר ל8-9 coverslips הזהב colloidal להתבצע.
7. ממשיך לערבב פתרון משולב זה לכ 2 דקות (הערה: הצבע של הפתרון ישתנה בהדרגה מצהובה קלושה, כדי לנקות, לאפור, לסגול, לסגול עמוק, ולבסוף לקחתי יין אדום או, עדיף, חלודת צבע) . מוצר זה הוא פתרון זהב colloidal שלך.
8. לקרר את פתרון זהב colloidal בפיפטה 10 מ"ל במשך 1-2 דקות (כדי לשמור על שכבת ג'לטין על coverslip מהפשרה כאשר פתרון הזהב colloidal נוסף) ולאחר מכן להוסיף 1.0-2.0 מ"ל של colloidaפתרון זהב l על כל coverslip ג'לטין מצופה הונח בעבר בצלחת 24 היטב (es) (כמות הזהב colloidal הפתרון שאתה מוסיף לcoverslips ג'לטין המצופה תלוי בכמה טוב את חלקיקי הזהב זרזו בפתרון - ראה הערות להלן).

הערה: מאחר שייתכן שיש הבדלים ביעילות של משקעי חלקיקי זהב, מומלץ להוסיף 1 0.5-1 מ"ל של תמיסת זהב colloidal לcoverslips ג'לטין המצופה ולאחר מכן הנח את הצלחת 24 היטב בחממה על 0.5 שעות . לאחר זמן דגירה זה, coverslips צריך להיבדק תחת מיקרוסקופ האור לצפיפות המתאימה של חלקיקי זהב על coverslips. ראה איור 1 ל20x תמונות מיקרוסקופיה דוגמאות של נמוך מדי או גבוה מדי ריכוז של חלקיקי זהב. ראה איור 2 לתמונות מיקרוסקופיות של 40X ריכוז אידיאלי של חלקיקי זהב (לפחות לשימוש עם מונוציטים). Optצפיפות imal של חלקיקי הזהב בשקופית צריכה להיקבע באופן ניסיוני לכל סוג תא ששמש, כמאפיינים של התאים השונים יכתיבו כוח תנועה שלהם על coverslips. אם הריכוז של חלקיקי זהב אינו מספק, מוסיף 0.5-1 מ"ל נוסף של פתרון זהב colloidal לcoverslips ג'לטין המצופה.

בהתאם לגודל התא, הריכוז המתאים של חלקיקי זהב יכול להשתנות, ולכן סופו של דבר תלוי בגודל של התא נבדק לתנועתיות. לדוגמה, עם מונוציטים אדם תאים קטנים בגודל (~ 10-20 מיקרומטר ^28), ריכוז גבוה של חלקיקי זהב היה צורך בניתוחים שלנו. ההפצה המתאימה של חלקיקי זהב מספקת חוקר עם היכולת בקלות וביעילות כדי להבדיל את הקצוות של מסלולים סלולריים. ריכוז של חלקיקי זהב שהוא גבוה מדי פוגע ביכולת של תאים לנוע ולכן כדי למדוד במדויק אתתנועתיות שלהם, ואילו ריכוז של חלקיקי זהב שהוא היכולת של אלה גבולות נמוכה מדי כדי להתוות מסלול מדויק של תנועתיות.

הערה חשובה: אם את הסינתזה של חלקיקי זהב היא בעייתית, חלקיקי זהב מסונתז זמינים מסחרי בגדלים מ 5 ננומטר עד 400 ננומטר. בנוסף, הניאון microspheres גם נעשה שימוש במחקרים של תנועתיות תא ^29. עם זאת, השימוש בmicrospheres אלה דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי לניתוח נדידת תאים.

9. מניח את הצלחת 24 היטב עם coverslips colloidal זהב מכוסה בחממה ב 37 ° C ו דגירה משעה 1 עד הלילה.
10. לאחר דגירה, לשטוף / להסיר זהב מאוגד על ידי הטבילה בcoverslips (3x) לפוספט סטרילי נאגר מלוח (PBS; pH 7.4).
11. הנח coverslips מצופה זהב colloidal אלה בצלחת 12-גם נקיה (es) המכילה PBS.
12. אחסן coverslips אלה ב 4 ° C עד מוכן לשימוש (הצלחת לפני ההכנסה למקרר parafilm).

הערה חשובה: תמיד לשמור על coverslips colloidal מצופה זהב בסוג כלשהו של נוזל / מדיה כמו חלקיקי הזהב יכולים להתקלף מcoverslips אם להתייבש. את coverslips הזהב colloidal יש להשתמש תוך 2-3 חודשים מהיום שהם עשו.

בקרת איכות: בבדיקת תנועתיות בודדה phagokinetic מסלול, זה קריטי לשימוש coverslips המתאפיינים בריכוז דומה של חלקיקי זהב. נקודה פשוטה זו תאפשר להבדלים כמותיים בתנועתיות סלולריות בין דגימות להיות אך ורק בשל טבעו של הטיפול ולא את התכונות הפיסיקליות של coverslips colloidal מצופה זהב. אנו בעד שימוש coverslips בלבד שנעשה באותו הזמן בניסויים נפרדים, למרות שהראינו שכל עוד את הצפיפות של חלקיקי הזהב שווה, השימוש בcoverslipsמהכנות שונות הוא מתאים.

3. ניתוח של כושר תנועה נייד

1. הנח את coverslips colloidal מצופה זהב במדיה הסלולריים המתאימים לתאים של עניין.
2. העברת תאים שטופלו כראוי על גבי coverslips colloidal מצופה זהב שהונח בצלחת 24 היטב (ES)

הערה: מספר התאים שהועברו לאחת גם צריכה להיות נקבע לכל סוג תא למד. באופן אידיאלי, תאים צריכים להיות מופצים באופן שווה על coverslip מצופה הזהב colloidal, אשר בתורו יאפשר ניתוח הסטטיסטי של פסים רק שנוצרו על ידי תא בודד. אם תאים מצופים בריכוז גבוה מדי, הוא הופך להיות אפשרות סביר בהחלט שמסלולים חופפים של מספר תאים שנראים. מסלולים חופפים לא ניתן נבדקים ומדויקים, ולכן, הם לא יכולים להילקח בחשבון בניתוח הסופי של התנועה של התאים הנבדקים. חפיפת מסלולים כתוצאה מהמעורבות של מספר תאים בדרך כלל נצפתה בקלות; כהתמזגה או חצה מסילה (בתחום של ניתוח) שבו ניתן להבחין שני תאים או יותר באותו האזור פינה רציף.

3. לדגור על 37 מעלות CO C / 5% ₂ עבור 24 שעות (או לכל זמן מתאים; למשל נתחנו תנועתיות monocyte בין 6 שעות ו 24 תאים שלאחר טיפול ואנדותל משאבי אנוש ב12 שעות לאחר טיפול). מסגרת הזמן האופטימלית לקביעת ומדידת תנועתיות סלולריות תשתנה בהתאם לסוג התא למד, ולכן צריך להיות בניסוי נקבע לכל סוג תא (נקודת התחלה טובה, לעומת זאת, היא 6-12 שעות לאחר טיפול).

הערה: אם coverslips מצופה זהב colloidal הניסיוני צריך להיות מאוחסן ו / או ניתוח במועד מאוחר יותר, תאים וחלקיקי זהב צריכים להיות קבועים על coverslips. כדי לבצע שלב זה קיבעון; השלב הבא 3.3, לשטוף 1 coverslips זהירות 2 פעמים עם 1xPBS (טבילה של coverslips עדיף, כהסרה של חלקיקי זהב מcoverslips יש להימנע), ואז להשתמש בשיטה סטנדרטית תא קיבעון, כגון דגירה עם paraformaldehyde טמפרטורת החדר 3%. לאחר דגירה 15-דקות, paraformaldehyde 3% יש להסיר ואת coverslips שטף 3 פעמים בזהירות עם 1x PBS. את coverslips הקבוע ניתן לאחסן במקרר.

4. השימוש במיקרוסקופ אור, ללכוד תמונות של מסלולים שנוצרו על ידי תא בודד נע (הערה: ההגדלה נהגה לקחת תמונות של מסלולים סלולריים בהחלט להשתנות בהתאם לסוג התא תחת חקירה). דוגמאות למסלולי הסלולר שנוצרו על ידי תאים הלא נעימים ובניע על coverslips colloidal מצופה זהב מוצגות באיור 2.

הערה: חלקיקי הזהב של הגודל השתמש בבדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic כבר מצא להיות רעיל לחלוטין לתאים ^30. במידת צורך, את הכדאיות של התאים שנבדקו ניתן להעריך על ידי הכתמה עם trypan כחול או בדקה לסמנים אחרים של כדאיות סלולרית. יהיה צורך לקחת בחשבון את הצורך בקיבוע, סוג של קיבעון, וכו ', אם צעד זה צריך להתבצע.

5. שימוש בתוכנה זמינה באופן חופשי, כמו ImageJ תוכנה (http://rsbweb.nih.gov/ij/) או NIH תמונה (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/), הן פתחו ב מכונים הלאומיים לבריאות, או ImageTool (http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html) שפותח באוניברסיטת טקסס למדעי בריאות במרכז סן אנטוניו, השטח הממוצע (ביחידות שרירותיות) של זהב colloidal פונה על ידי 10-20 תאים או יותר (לדוגמה) נקבעים לכל יד ניסיונית מתמונות שנתפסו. סטטיסטיקה אז יכולה להיות מבוצעת על tהוא אסף תוצאות. לדוגמה, תוצאות ניתן להתוות כמשמעות ± סטיות ההתקן של האמצעי (SEM) עם בדיקות של סטודנטי t שבוצעו, וערך P של <0.05 משמשים כמדד למובהקות סטטיסטיות בין דגימות. תרשימי 3 ו 4 צעדי ראווה ב ניתוח של השטח של זהב colloidal פונה על ידי התא.

תוצאות

הראה דוגמה של תמונות שצולמו במיקרוסקופ אור מראה אזור מסלול המסומן על ידי תא בודד (monocyte מהניסויים שלנו מוצגת באיור 2). תאים ללא ניעתי ליצור, סגלגלים קטנים אופייניים או שטחים בצורת העיגול סביב עצמם מעידים על רמה בסיסית נמוכה של תנועה לתאי unstimulated אלה (איורים...

Discussion

בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic הוצגה במאמר זה היא שיטה פשוטה ויעילה ביותר לניתוח כמותי של נדידת תאים. כי ניתן לנתח סוגי תאים מרובים ^9-17, לשיטה זו יש שימוש הרחב הפוטנציאל על פני תחומים רבים. השימוש בcoverslips הזכוכית מצופית זהב colloidal מאפשר מדידה של אזור מסלול המסומן על י?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
Coverslips זכוכית (15 מ"מ)	הפישר סיינטיפיק	12-545-83
300 בלום ג'לטין	סיגמה אולדריץ	G-1890
הידראט החומצה Tetrachloroauric	פישר כימי	G54-1	14.5 מ"מ (פתרון עבודה סופי)
ציטראט נתרן	הפישר סיינטיפיק	BP327-500	0.5% (פתרון עבודה סופי)
Paraformaldehyde	הפישר סיינטיפיק	O4042	3% (פתרון עבודה סופי)
תבשיל תרבית רקמה 100 מ"מימ	Sarstedt	83.1802
צלחות 12-Well	הפישר סיינטיפיק	08-772-29
צלחות 24 Well	הפישר סיינטיפיק	07-200-84
טכנה התנור Hybridiser HB-1D	LabPlanet	2040500	תנור המעבדה הסטנדרטית יספיק
10 פיפטות serological מ"ל	Sarstedt	86.1254.001
פילר Pipet-Aid / Dispenser	דראמונד	13-681-15
P200 Single-Channel הידני פיפטה	יורד גשם	PR-200
200 טיפי גדר מ"ל	CLP	BT200
ImageJ תוכנה	HTTp :/ / rsb.info.nih.gov / ij /		רישיון: נחלת כלל
ניקון אקליפס TE300 עם photometrics CoolSNAPfx מונוכרום מצלמת CCD 12-bit	ניקון		הופסק; המפרט הדומה ביותר יש ניקון אקליפס טי, אבל קצה תחתון ניקון 80i יהיה מתאים גם כן. מותגים אחרים גם מספקים מיקרוסקופים דומים.
			הערה: ריאגנטים והציוד המפורטים להלן כבר נוצלו על ידי אותנו במחקרים השונים שלנו. אספקה ​​אחרת, ספקים, ריאגנטים וציוד ניתן להשתמש, כל עוד יש להם מפרט דומה.