生物发光细菌成像<em在体内</em

摘要

本文介绍了管理勒克斯标签

摘要

本视频介绍了使用全身生物发光成像（BLI）的细菌贩运活体小鼠为研究对象，利用细菌基因和细胞治疗癌症的重点。存在的细菌有吸引力的载体类用于癌症治疗，全身用药后，肿瘤内优先发展拥有一种天生的能力。细菌的设计，以表达勒克斯基因盒许可证BLI检测的细菌和兼肿瘤部位。肿瘤内随着时间的推移的位置和水平的细菌，可以容易地检查，在两维或三维可视化。的方法，是适用于范围广泛的细菌物种和肿瘤异种移植类型。本文介绍了发光细菌在皮下荷瘤小鼠的协议分析。可视化的共生细菌的胃肠道（GIT）中由BLI也被描述。这种功能强大，而且价格便宜，实时成像战略的代表中TS细菌在体内的背景下，特别是基因治疗，癌症研究，传染病研究的一个理想的方法。此视频概述了研究勒克斯标记E.程序大肠杆菌活体小鼠，展示的空间和时间的读出可以实现利用BLI的IVIS系统。

研究方案

1。诱发肿瘤

1. 对于常规的肿瘤诱导，悬浮在200μl的无血清培养基中的细胞的的最低致瘤剂量皮下注射（SC）的到感染的侧翼免费的6-8周龄的雌性Balb / C或无胸腺MF1-nu/nu小鼠的中N = 6（哈伦，英国牛津）（1×10 ⁶ 4T1细胞），使用21号注射器针头。用于接种的细胞的存活率大于95％，使用血细胞计数器和台盼蓝染料排除（Gibco）中通过目视计数来确定。
2. 肿瘤成立后，肿瘤被允许的成长和发展，并进行了监测，每周两次。根据公式 V =（从头^2）Π/ 6， 其中 a为肿瘤的最长直径之和 b是最长的直径垂直的直径为a，计算肿瘤体积。

2。细菌制剂

1. 在此protoco使用的细菌菌株L是E。大肠杆菌K-12 MG1655株，非蛋白毒素表达株，窝藏luxABCDE编码，使所要检测的细菌的质粒BLI。E.大肠杆菌 MG1655含有集成luxABCDE的生长需氧条件下，在37℃下在LB培养基（Sigma-Aldrich公司，爱尔兰）与300微克/毫升红霉素（EM）的补充。的生物发光衍生MG1655创建，使用质粒p16S 勒克斯其中包含组成P的_帮助 luxABCDE操纵的。
2. 对于准备对小鼠给药，在LB培养基中培养的培养物在37℃下在摇床上以200rpm中期日志相（在600nm处的光密度）。收获细菌，通过离心分离（6,000×g离心5 min），用PBS（Sigma公司）洗涤，并稀释在PBS中1×10 ⁷菌落形成单位（cfu）/ ml的静脉注射，或^1×10 10管饲法。

3。细菌管理员TION

1. 将小鼠随机分为实验组，当肿瘤达到约100毫米的体积。对于静脉内给药，内敛小鼠每个收到的10 ^6个细胞在100μl，直接注射到横向的尾静脉，用28G注射器针头。每个接种活菌计数进行回顾性电镀。
2. GIT殖民研究中，10 ⁹细菌细胞在每100微升鼠标口服灌胃，连续三天。预先存在的共生细菌水平明显下降之前，添加5毫克/毫升链霉素的鼠标饮用水喂养7天前开始口灌胃^1。

4。生物发光成像

1. 2D 体内 BLI成像进行使用IVIS100（钳）。在特定的时间点后细菌性管理，小鼠Caliper的XGI-8气体​​麻醉的麻醉在高灵敏度的2-5分钟，用3％的异氟烷​​，和全身图像分析系统中进行的IVIS 100系统。
2. 的三维成像，麻醉小鼠放置在鼠标摄像穿梭背侧成像（IVIS频谱，钳）的光学成像系统的内部。要获得的细菌荧光素酶信号的三维光学重建的图像，发射滤光器的波长范围从500-580纳米，与箱16采集时间3-4分钟每滤波器信噪比最大化使用。该图像采集序列的一部分，结构光图像定义一个高度的地图。本地图的时间输入的漫射光成像体层摄影术（DLIT）重建的算法被用来形成一个三维的光学图像，用一个非负最小二乘优化^2。
3. 图像分析：利用活体成像软件（钳）地区的利益进行了定性和定量分析。

5。代表结果

在这项研究中，非致病共生细菌的大肠杆菌K-12 MG1655表达luxABCDE操纵子是四轴承SC 4T1异种移植肿瘤的小鼠给药。细菌勒克斯信号，特别是在检测到肿瘤的小鼠IV给药后（ 图2）。从样品小鼠细菌培养回收验证存在的活菌数和检测的光的量（ 图3）之间的线性关系。 在体内成像口服给药的共生细菌在GIT中也取得了使用3D BLI。

图1。协议的时间轴 。诱导小鼠皮下肿瘤，细菌和管理后，肿瘤发展计划（100毫米）。活体小鼠BLI IM年龄在不同的时间点后细菌性管理（箭头表现出典型的）。

图2。管理E.在MF1 nu / nu小鼠和E. 大肠杆菌 MG1655 luxABCDE荷瘤小鼠皮下 4T1肿瘤诱导大肠杆菌 MG1655 luxABCDE管理后，肿瘤的发展。每个动物接受10 ⁶细胞直接注射到尾静脉。在研究过程中在四个时间点（黑点z轴和图像）与随后的恢复的活菌（菌落形成单位）从样本处死小鼠肿瘤（条形图）对小鼠进行成像。特别是在观察肿瘤随着时间的推移（代表鼠标每个时间点所示）中的细菌数量和质粒基因表达增加。 点击这里查看大图 。

图3。肿瘤后，BLI在不同的时间点后静脉给药， 瘤内细菌数量和生物发光的关系。存活的细菌在肿瘤中列举的体外细菌培养。登录值，细菌总数（CFU）与​​体内生物发光单元的绘制。一个强大的细菌的数量和细菌的生物发光信号之间的相关性R ² = 0.9717 ^1。

图4。 3D IVIS图片的小鼠胃肠道的殖民地E.大肠杆菌 MG1655的被殖民统治的小鼠口服10 ⁹ cfu的E. GIT 大肠杆菌连续三天。从3D成像的殖民鼠标的样本孤立的形象显示。3D影像显示鼠标数字地图集的骨架，提供解剖学注册。E.大肠杆菌 MG1655的生物发光是在绿色可见在较低的，和紫色在较高的水平。

讨论

在基因治疗的情况下，交付的基因治疗给患者使用生物制剂表现出极大的承诺^3-5。如病毒，细菌先天的生物学性质允许高效的DNA传递到细胞或组织，特别是在癌症的上下文中。它已被证明细菌是自然能归巢到肿瘤全身给药时，所得的复制水平高的地方，无论是外部的（非侵入性的物种）或肿瘤细胞（病原体）内。癌特异性的细菌复制最初归因于缺氧的固体肿瘤的性质（低O ₂水平）...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论
4T1细胞系	ATCC	CRL-2539	同系来自一个自发​​产生的BALB / c小鼠乳腺肿瘤的乳腺癌模型
DMEM	Sigma-Aldrich公司	D6429	Dulbecco改良的Eagle培养基
PBS	Sigma-Aldrich公司	D8537	磷酸盐缓冲液
精诺真IVIS	卡尺生命科学		IVIS 100的二维成像IVIS为3D的频谱。
卢里亚肉汤米勒（LB）	Sigma-Aldrich公司	L2542	生长培养基E.大肠杆菌
红霉素	Sigma-Aldrich公司	E5389	抗生素
链霉素	Sigma-Aldrich公司	S9137	抗生素
MF1nu/nu小鼠	哈伦（英国）	069（女）/ 070（NU / +）	HSD：裸鼠Foxn1nu的
Balb / c小鼠	哈伦（英国）	066	单倍型：H-2天
灌胃针	兽医技术解决方案（英国）	DE009	22G×38毫米直灌胃针
注射器静脉注射	BD Biosciences公司	309309 - 1毫升	胰岛素注射器与28 G X½英寸的微细四针。
肿瘤接种的注射器	布劳恩	9161376V	Omnifix 26 G X＆frac12寸毫针