Bioluminescent Bakterielle Imaging<em&gt; In Vivo</em

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Verwaltung von Lux-getaggten Bakterien an Mäusen und anschließende In vivo Analyse mit IVIS Biolumineszenz-Bildgebung.

Zusammenfassung

Dieses Video beschreibt den Einsatz des ganzen Körpers bioluminesce Imaging (BLI) für die Untersuchung von bakteriellen Handel mit lebenden Mäusen, mit einem Schwerpunkt auf der Verwendung von Bakterien in der Gen-und Zelltherapie bei Krebs. Bakterien stellen eine attraktive Klasse von Vektor für die Krebstherapie, die über eine natürliche Fähigkeit, vorzugsweise wachsen innerhalb Tumoren nach systemischer Verabreichung. Bakterien entwickelt, um die lux Genkassette Erlaubnis BLI Nachweis der Bakterien und gleichzeitig Tumorstellen auszudrücken. Die Lage und Höhe der Bakterien innerhalb Tumoren im Laufe der Zeit leicht geprüft werden kann, visualisiert in zwei oder drei Dimensionen. Das Verfahren ist für ein breites Spektrum von Bakterien-Spezies und Tumorxenotransplantat Typen. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für die Analyse der Biolumineszenz Bakterien im subkutanen Tumor tragenden Mäusen. Visualisierung von symbiotischer Bakterien im Magen-Darm-Trakt (GIT) von BLI wird ebenfalls beschrieben. Diese leistungsstarke und billig, Bildgebung in Echtzeit Strategie Vertreterts eine ideale Methode zur Untersuchung von Bakterien in vivo im Kontext der Krebsforschung, insbesondere Gentherapie, und Infektionskrankheiten. Dieses Video beschreibt das Verfahren für die Untersuchung lux-markierten E. coli in lebenden Mäusen, zeigt die räumliche und zeitliche Auslesen erreichbaren Nutzung BLI mit dem IVIS System.

Protokoll

Ein. Tumorinduktion

1. Für die Routine Tumorinduktion wurde die minimale tumorigenen Dosis von Zellen in 200 ul serumfreiem Kulturmedium suspendiert subkutan (sc) in die Flanke frei von Infektionen 6-8 Wochen alte weibliche Balb / C oder athymischen MF1-nu/nu Mäusen injiziert n = 6 (Harlan, Oxfordshire, UK) (1 x 10 ⁶ 4T1-Zellen) mit einer 21-Gauge Injektionsnadel. Die Lebensfähigkeit der Zellen zur Inokulation verwendet wurde, war größer als 95%, wie durch visuelle Zählung mit einem Hämozytometer und Trypan Blue Dye Exclusion (Gibco) bestimmt.
2. Nach Tumor-Gründung, wurden Tumoren erlaubt, zu wachsen und zu entwickeln und wurden zweimal wöchentlich überwacht. Das Tumorvolumen wurde gemäß der Formel V = (ab ²⁾ Π / 6, wobei a der längste Durchmesser des Tumors ist und b der längste Durchmesser senkrecht zu a Durchmesser berechnet.

2. Bakterielle Zubereitung

1. Der Bakterienstamm in diesem Protokolls in verwendetenIch war E. coli K-12 MG1655, ein Nicht-Protein-Toxin-exprimierenden Stamm, beherbergen eine luxABCDE-codierenden Plasmid, indem die Bakterien nachgewiesen werden können BLI. E. coli MG1655 enthaltend die integrierte luxABCDE wurde aerob bei 37 ° C in LB-Medium (Sigma-Aldrich, Irland) werden mit 300 ug / ml Erythromycin (Em) ergänzt. Die Biolumineszenz Derivat des MG1655 wurde mit dem Plasmid p16S lux, welche die konstitutive P _HELP luxABCDE Operon ¹ enthält.
2. Für die Zubereitung für die Verabreichung an Mäuse wurden die Kulturen in LB-Medium bei 37 ° C in einem Schüttler bei 200 UpM inkubiert bis zur mittleren logarithmischen Phase (optische Dichte bei 600 nm). Bakterien wurden durch Zentrifugation (6.000 × g für 5 min) gewaschen, mit PBS (Sigma), verdünnt in PBS und 1 × 10 ⁷ koloniebildenden Einheiten (KBE) / ml für intravenöse Verabreichung oder 1 x ¹⁰ 10 für Schlundsonde.

3. Bakterielle Administrationtion

1. Mäuse wurden randomisiert in Versuchsgruppen eingeteilt, wenn Tumoren erreicht etwa 100 mm ³ im Volumen. Für die intravenöse Verabreichung erhalten zurückhaltende Mäusen je 10 ⁶ Zellen in 100 ul, direkt in die laterale Schwanzvene mit einer 28G Injektionsnadel injiziert. Die Keimzahl jeder Inokulum wurde durch nachträgliche Beschichtung bestimmt.
2. Für GIT Kolonisierung Studien wurden 10 ⁹ Bakterienzellen oral in 100 ul pro Maus über eine Sonde verabreicht, an drei aufeinanderfolgenden Tagen. Vorbestehenden kommensalen Bakterien-Spiegel wurden vor dem Zuführen durch Zugabe von 5 mg / ml Streptomycin in Maus Trinkwasser für 7 Tage vor dem Beginn der Schlundsonde ¹ verringert.

4. Biolumineszenz-Bildgebung

1. 2D in vivo Bildgebung BLI wurde unter Verwendung des IVIS100 (Bremssattel). Zu definierten Zeitpunkten nach bakteriellen Verwaltung, wurden die Mäuse betäubt mit Caliper die XGI-8 Gas AnästhesieSystem mit 3% Isofluran und Ganzkörper-Bildanalyse in der IVIS 100 für 2-5 min bei hoher Empfindlichkeit durchgeführt.
2. Bei 3D-Bildgebung, wurden anästhesiert Mäusen in einem Maus-Bildgebung Shuttle Innenseite des optischen Abbildungssystem zum dorsalen Bildgebung (IVIS Spectrum, Zangenbremse) platziert. Um Bilder des bakteriellen Luciferase Signal für 3D optische Rekonstruktion erwerben wurden Emissionsfilter Wellenlängen im Bereich von 500 bis 580 nm mit bin 16 Erfassungszeiten von 3-4 min pro Filter, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren. Als Teil dieser Abfolge Bildaufnahme wurde ein strukturiertes Licht erhaltenen Bildes, um eine Höhe der Karte zu definieren. Diese Karte eingegeben wurde diffuse Licht bilderzeugende Tomographie (DLIT) Rekonstruktionen Algorithmen, die verwendet werden, um ein 3D Bild unter Verwendung eines optischen nichtnegative kleinsten Quadrate Optimierung ^{2 zu} bilden waren.
3. Image Analysis: Regionen von Interesse wurden identifiziert und quantifiziert mit Wohn Image Software (Caliper).

5. VertreterErgebnisse

In dieser Studie wurden die nicht-pathogenen kommensalen Bakterien E.coli K-12 MG1655 Exprimieren des luxABCDE Operon war IV Mäusen sc 4T1 Xenograft verabreicht. Bakterielle lux Signal wurde speziell in Tumoren von Mäusen nachgewiesen post IV-Verwaltung (Abbildung 2). Kultur von Bakterien aus Erholung Probe Mäusen validiert die Existenz eines linearen Zusammenhangs zwischen lebensfähigen Bakterienzahl und der Lichtmenge erfasst wird (Abbildung 3). In vivo Bildgebung von oral verabreichten kommensalen Bakterien im GIT wird auch unter Verwendung von 3D BLI.

Abbildung 1. Protokoll Timeline. Subkutanen Tumoren in Mäusen induziert und Bakterien auf Tumor-Entwicklung (100 mm ³⁾ verabreicht wird. Live-Mäuse sind BLI imAlter an verschiedenen Zeitpunkten nach bakteriellen Verwaltung (Pfeile zeigen typische mal).

Abbildung 2. Verwaltung von E. coli MG1655 luxABCDE um tumortragenden Mäusen. Subkutane 4T1 Tumoren wurden in MF1 nu / nu Mäusen und E. induzierte coli MG1655 luxABCDE auf Tumor-Entwicklung verwaltet. Jedes Tier erhielt 10 ⁶ Zellen direkt in die laterale Schwanzvene injiziert. Die Mäuse wurden zu vier Zeitpunkten während der Studie (schwarze Punkte z-Achse und Bilder) mit anschließender Wiederherstellung lebensfähiger Bakterien (cfu) aus Tumoren von Probe geopfert Mäusen (Balkendiagramm) abgebildet wird. Erhöhung der Keimzahlen und Plasmid-Genexpression spezifisch in Tumoren wurde im Laufe der Zeit (Vertreter Maus pro Zeitpunkt dargestellt) beobachtet. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 3. Relationship Between Intratumorale Bakterienzahl und Biolumineszenz. Lebensfähigen Bakterien in Tumoren wurden durch ex vivo Bakterienkultur von Tumoren im Anschluss an BLI an verschiedenen Zeitpunkten nach intravenöser Verabreichung aufgezählt. Anmelden Werte Keimzahlen (KBE) in Bezug auf in vivo bioluminesce Einheiten werden grafisch dargestellt. Eine robuste Korrelation zwischen Keimzahlen und bakteriellen Biolumineszenz-Signale beobachtet R ² = 0,9717 ^ein.

Abbildung 4. 3D IVIS Image Of Murine Gastrointestinal Tract kolonisiert von E. coli MG1655. Das GIT von Mäusen wurde durch orale Verabreichung von 10 ⁹ cfu E. kolonisiert coli an drei aufeinanderfolgenden Tagen. Eine Probe isoliert Bild von 3D-Tomographie des kolonisierten Maus gezeigt.3D-Bilder zeigen eine digitale Maus atlas des Skeletts an anatomische Registrierung ein. E. coli MG1655 Biolumineszenz ist sichtbar in grün bei niedrigeren und lila auf höheren Ebenen.

Diskussion

Im Rahmen der Gentherapie hat sich die Verwendung von biologischen Agenzien zur Abgabe von therapeutischen Genen für Patienten sehr vielversprechend ^3-5 gezeigt. Wie Viren erlauben die angeborenen biologischen Eigenschaften von Bakterien effizienten DNA-Abgabe an Zellen oder Gewebe, insbesondere im Zusammenhang mit Krebserkrankungen. Es hat sich gezeigt, daß Bakterien in der Lage sind natürlich Homing auf Tumoren, wenn systemisch verabreicht, was zu hohen Replikation lokal entweder außerhalb (nicht-invasi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
4T1-Zelllinie	ATCC	CRL-2539	Syngenen Brustkrebs-Modell aus einer spontan entstehenden BALB / c Brusttumor abgeleitet
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline
Xenogen IVIS	Caliper Life Sciences		IVIS 100 für 2D-Bildgebung; IVIS Spectrum für 3D.
Luria Broth Miller (LB)	Sigma-Aldrich	L2542	Wachstumsmedium für E. coli
Erythromycin	Sigma-Aldrich	E5389	Antibiotikum
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S9137	Antibiotikum
MF1nu/nu Mäusen	Harlan (UK)	069 (nu) / 070 (nu / +)	Hsd: athymischer-Foxn1nu
Balb / c-Mäusen	Harlan (UK)	066	Haplotyp: H-2 d
Gavage Nadel	Vet-Tech-Solutions (UK)	DE009	22G x 38mm gerade Magensonde Nadel
Spritze für iv Injektion	BD Biosciences	309.309 bis 1 ml	Insulinspritze mit 28 G x ½ Zoll mikro-feinen IV Nadel.
Spritze für Tumorinokulation	Braun	9161376V	Omnifix 26 G x ½ Zoll-Nadel