Imágenes bacteriana Bioluminiscente<em&gt; En Vivo</em

Resumen

En este artículo se describe la administración de Lux-etiquetado Bacterias a ratones y posteriores In vivo Análisis utilizando imágenes IVIS bioluminiscencia.

Resumen

Este video describe el uso de todo el cuerpo bioluminesce formación de imágenes (BLI) para el estudio del tráfico bacteriana en ratones vivos, con énfasis en el uso de bacterias en terapia génica y celular para el cáncer. Las bacterias presentes una clase de vector atractivo para la terapia del cáncer, que posee una capacidad natural para crecer preferentemente dentro de los tumores después de la administración sistémica. Las bacterias genéticamente para expresar el gen lux casete permiso BLI detección de las bacterias y al mismo tiempo sitios de tumor. La ubicación y los niveles de las bacterias dentro de los tumores con el tiempo puede ser fácilmente examinado, visualizado en dos o tres dimensiones. El método es aplicable a una amplia gama de especies bacterianas y tipos de tumores de xenoinjertos. En este artículo se describe el protocolo para el análisis de bacterias bioluminiscentes en ratones portadores de tumores subcutáneos. La visualización de las bacterias comensales en el tracto gastrointestinal (GIT) por BLI también se describe. Este potente y barato, imágenes en tiempo real representación estrategiats un método ideal para el estudio de las bacterias in vivo en el contexto de la investigación del cáncer, en terapia génica particular, y las enfermedades infecciosas. Este video muestra el procedimiento para el estudio de lux-etiquetados E. coli en ratones vivos, lo que demuestra la lectura espacial y temporal alcanzable BLI utilizar con el sistema IVIS.

Protocolo

1. La inducción de tumores

1. Para la inducción de tumores de rutina, la dosis tumorígena mínima de células suspendidas en 200 l de medio de cultivo libre de suero se inyecta por vía subcutánea (sc) en el flanco de la infección libre de 6-8 semanas de edad hembras Balb / C o ratones atímicos MF1-nu/nu n = 6 (Harlan, Oxfordshire, Reino Unido) (1 x 10 ⁶ células 4T1) utilizando una aguja de jeringa de calibre 21-. La viabilidad de las células utilizadas para la inoculación fue mayor que 95% según se determinó por recuento visual usando un hemocitómetro y la exclusión del colorante azul de tripano (Gibco).
2. Después del establecimiento del tumor, los tumores se dejaron crecer y desarrollar y se monitorizó dos veces semanalmente. El volumen del tumor se calculó según la fórmula V = (ab ²⁾ Π / 6, donde a es el diámetro más largo del tumor y b es el diámetro más largo perpendicular a un diámetro.

2. Preparación bacteriana

1. La cepa bacteriana utilizada en este PROTOCOLO DEl fue E. coli K-12 MG1655, una proteína no-toxina que expresa cepa, que alberga un plásmido luxABCDE-codificación que permite a las bacterias para ser detectada por BLI. E. coli MG1655 que contienen el luxABCDE integrado se cultivó aeróbicamente a 37 ° C en medio LB (Sigma-Aldrich, Irlanda) suplementado con 300 mg / ml de eritromicina (Em). El derivado de MG1655 bioluminiscente se ha creado con el plásmido p16S lux que contiene la _AYUDA P constitutiva luxABCDE operón ^1.
2. Para la preparación para administración a ratones, los cultivos se incubaron en medio LB a 37 ° C en un agitador a 200 rpm hasta la fase logarítmica media-(densidad óptica a 600 nm). Las bacterias fueron cosechadas por centrifugación (6.000 xg durante 5 min), se lavaron con PBS (Sigma), y se diluyó en PBS 1 × 10 ⁷ unidades formadoras de colonias (ufc) / ml para la administración IV, o 1 x ¹⁰ 10 de alimentación forzada.

3. Bacteriana Administraciónción

1. Los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos experimentales cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm ³ en volumen. Para la administración intravenosa, los ratones recibieron cada uno restringidas 10 ⁶ células en 100 l, se inyecta directamente en la vena lateral de la cola usando una aguja de jeringa 28G. El recuento de viables de cada inóculo se determinó mediante siembra retrospectiva.
2. Para los estudios de colonización GIT, 10 ⁹ células bacterianas se administra por vía oral en 100 l por ratón por sonda, en tres días consecutivos. Preexistentes niveles de bacterias comensales se redujeron antes de la alimentación mediante la adición de 5 mg / ml de estreptomicina en el agua potable del ratón durante 7 días antes del comienzo de sonda oral ^1.

4. Bioluminiscencia de imágenes

1. 2D in vivo BLI imágenes se realizó usando el IVIS100 (pinza). En la administración de tiempo definido después de los puntos bacteriana, los ratones fueron anestesiados utilizando XGI-8 Caliper Anestesia GasSistema con 3% isofluorano, y todo el cuerpo de análisis de imágenes se realizó en el sistema IVIS 100 para 2-5 min a una sensibilidad alta.
2. Para imágenes en 3D, los ratones anestesiados se colocaron en un servicio de transporte de imágenes del ratón dentro del sistema de formación de imágenes ópticas para obtener imágenes de dorsal (IVIS Spectrum, Caliper). Para adquirir imágenes de la señal de luciferasa bacteriana para la reconstrucción óptica 3D, longitudes de onda de emisión de filtro que van desde 500 hasta 580 nm se utilizaron con tiempos de adquisición de bin 16 min de 3-4 por filtro para maximizar la relación señal a ruido. Como parte de esta secuencia de adquisición de imágenes, una imagen de luz estructurada se obtuvo para definir un mapa de altura. Este mapa fue difusa luz de entrada de imágenes de tomografía (dlit) reconstrucciones algoritmos que se utilizan para formar una imagen en 3D óptica usando un no negativo mínimo optimización cuadrados ^2.
3. Análisis de imágenes: Las regiones de interés se identificaron y cuantificaron utilizando el software Image estar (pinza).

5. RepresentanteResultados

En este estudio, las bacterias no patógenas comensales E. coli K-12 MG1655 que expresa el operón luxABCDE fue IV administrada a ratones portadores de xenoinjertos de tumores sc 4T1. Señal bacteriana lux se detectó específicamente en los tumores de los ratones después de administración IV-(Figura 2). Recuperación cultivo de bacterias a partir de ratones de muestra valida la existencia de una relación lineal entre el número de bacterias viables y la cantidad de luz detectada (Figura 3). Imágenes in vivo de administración oral las bacterias comensales en el GIT se consigue también el uso de 3D ​​BLI.

Figura 1. Protocolo de línea de tiempo. Tumores subcutáneos son inducidos en ratones, y bacterias administrado en el desarrollo del tumor (100 mm ^3). Ratones vivos son BLI imaños en la administración de diferentes puntos de tiempo posteriores bacteriana (flechas muestran los tiempos típicos).

Figura 2. Administración de E. coli MG1655 luxABCDE a ratones portadores de tumor. subcutáneos tumores 4T1 fueron inducidos en MF1 ratones nu / nu y E. coli MG1655 luxABCDE administrado en el desarrollo del tumor. Cada animal recibió 10 ⁶ células inyectadas directamente en la vena lateral de la cola. Los ratones fueron imágenes a cuatro puntos de tiempo durante el estudio (puntos negros eje z e imágenes) con la subsiguiente recuperación de bacterias viables (cfu) de tumores de los ratones sacrificados de muestra (gráfico de barras). Aumento en el número de bacterias y la expresión génica en tumores específicamente plásmido se observó en el tiempo (ratón representante ilustrado por punto de tiempo). Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 3. Relación entre el número de bacterias intratumorales y bioluminiscencia. Bacterias viables en los tumores fueron enumerados por ex cultivo bacteriano vivo de tumores posteriores a BLI en varios puntos de tiempo después de la administración IV. Los valores de log del número de bacterias (ufc) en relación con las unidades in vivo bioluminesce se grafican. Se observó una correlación robusta entre la carga bacteriana y señales bacterianas bioluminiscencia se observa R ² = 0,9717 ^1.

Figura 4. 3D Image IVIS del tracto gastrointestinal murino colonizados por E. coli MG1655. El tracto gastrointestinal de los ratones fue colonizada por la administración oral de 10 ⁹ ufc de E. coli por tres días consecutivos. Una imagen muestra aislada de tomografía 3D del ratón colonizados se muestra.Imágenes en 3D muestran un atlas ratón digital del esqueleto para proporcionar un registro anatómica. E. coli MG1655 bioluminiscencia es visible en verde en la inferior, y púrpura a niveles más altos.

Discusión

En el contexto de la terapia génica, la utilización de agentes biológicos para la entrega de genes terapéuticos a los pacientes ha demostrado una gran promesa ^3-5. Al igual que los virus, las propiedades biológicas innatas de bacterias permitir el suministro eficiente de ADN a células o tejidos, en particular en el contexto del cáncer. Se ha demostrado que las bacterias son naturalmente capaces de homing a los tumores por administración sistémica que resulta en niveles altos de replicación a nivel l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Línea celular 4T1	ATCC	CRL-2539	Mama singénico modelo de cáncer derivado de un surja espontáneamente BALB / c tumor mamario
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco modificada de Eagle
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline
Xenogen IVIS	Caliper Life Sciences		IVIS 100 para imágenes 2D; Spectrum IVIS para 3D.
Caldo Luria Miller (LB)	Sigma-Aldrich	L2542	Crecimiento medio para E. coli
Eritromicina	Sigma-Aldrich	E5389	Antibiótico
Estreptomicina	Sigma-Aldrich	S9137	Antibiótico
MF1nu/nu ratones	Harlan (UK)	069 (nu) / 070 (nu / +)	HSD: atímicos Nude-Foxn1nu
Ratones Balb / c	Harlan (UK)	066	Haplotipo: H-2 d
Aguja Gavage	Vet tecnología Solutions (Reino Unido)	DE009	22G x 38 mm aguja sonda recta
Jeringa para inyección IV	BD Biosciences	309309 a 1 ml	La insulina jeringa con 28 G x ½ pulgada micro-fina aguja intravenosa.
Jeringa para la inoculación del tumor	Braun	9161376V	Omnifix 26 G x ½ aguja pulgadas