הדמיה בקטריאלי bioluminescent<em&gt; In Vivo</em

Summary

מאמר זה מתאר את הממשל של מתויג לוקס חיידקים לעכברים ולאחר מכן In vivo ניתוח באמצעות הדמית פליטת אור IVIS.

Abstract

וידאו זה מתאר את השימוש בגוף כולו bioluminesce ההדמיה (BLI) ללימודי סחר חיידקים בעכברים חיים, עם דגש על השימוש בחיידקים בגן וטיפול בתאי סרטן. חיידקים המצויים ברמה אטרקטיבית של וקטור לטיפול בסרטן, בעל יכולת טבעית לגדל מעדיף בתוך גידולים בעקבות מנהל מערכתי. חיידקים שהונדסו גנטי איתור לוקס קלטת היתר BLI של החיידק סרטניים ואתרים במקביל. המיקום ורמות חיידקים בתוך גידולים לאורך זמן, ניתן לבדוק בקלות, דמיין בשניים או שלושה ממדים. השיטה ישימה למגוון רחב של מינים וסוגי חיידקי xenograft סרטניים. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לניתוח של חיידקים בתוך bioluminescent עכברי נושאים גידולים תת עורי. ויזואליזציה של חיידקי commensal במערכת העיכול (git) על ידי BLI גם תארה. יציג זה חזק, וזול, בזמן אמת הדמית אסטרטגיהts שיטה אידיאלית לחקר חיידקים בחי בהקשר של חקר הסרטן, בטיפול בגן מסוים, ומחלות זיהומיות. סרטון זה מתאר את ההליך ללימוד ה-Lux מתויג coli בעכברים חיים, הוכחת BLI readout מרחב ובזמן להשגת ניצול עם מערכת IVIS.

Protocol

1. אינדוקצית גידול

1. לזירוז גידול שגרתי, המינון המינימאלי של תאים הסרטניים מושעים ב200 μl של התרבות בינונית סרום ללא הוזרק תת עורית (SC) לתוך האגף של זיהום החופשי בשבוע 6-8 עכברי BALB / C או athymic נשיים ישנים MF1-nu/nu n = 6 (הרלן, אוקספורדשייר, בריטניה) (1 x 10 ⁶ תאים 4T1) באמצעות מחט מזרק 21-מד. הכדאיות של תאים המשמשים לחיסון הייתה גבוה מ 95%, כפי שנקבע על ידי ספירה חזותית באמצעות haemocytometer והדרת צבע הכחול Trypan (Gibco).
2. בעקבות הקמת גידול, גידולים הורשו לגדול ולהתפתח והיו במעקב פעמים בשבוע. נפח גידול היה מחושב לפי נוסחת V = (ab ²⁾ Π / 6, שבו הוא הארוך ביותר בקוטר של גידול ואילו b הוא ניצב הקוטר הארוך ביותר לקוטר.

2. הכנת קטריאלי

1. זן החיידקים המשמש בprotoco זהאני היה א coli K-12 MG1655, שאינו החלבון הרעלן-להביע מתח, מחסה luxABCDE קידוד פלסמיד המאפשר לחיידקים להיות מזוהים על ידי BLI. א coli MG1655 המכיל luxABCDE המשולב היה גדל אירובי על 37 מעלות צלזיוס במדיום LB (סיגמה אולדריץ, אירלנד) בתוספת 300 מיקרוגרם / המ"ל אריתרומיצין (EM). הנגזרת של bioluminescent MG1655 נוצרה באמצעות p16S לוקס פלסמיד המכיל את _עזרת P המכוננת luxABCDE ¹ אופרון.
2. להכנה לממשל לעכברים, תרבויות הודגרו במדיום LB על 37 מעלות צלזיוס בייקרה ב 200 סל"ד לשלב יומן האמצע-(צפיפות אופטית ב 600 ננומטר). חיידקים נקצרו ידי צנטריפוגה (6,000 × גרם למשך 5 דקות), נשטפו עם PBS (סיגמא), ודילול ב1 × PBS 10 ⁷ יחידות מושבה להרכיב (CFU) / מ"ל עבור IV ממשל, או 1 x ¹⁰ 10 לgavage.

3. Administra קטריאליtion

1. עכברים חולקו באופן אקראי לקבוצות ניסוי, כאשר גידולים הגיעו לכ 100 מ"מ ³ בנפח. עירוי לוריד, עכברים מאופקים כל אחד קבלו 10 ⁶ תאים ב100 μl, מוזרקים ישירות לוריד הזנב לרוחב באמצעות מחט מזרק 28g. ספירת הקיימא של כל בידוד נקבעה על ידי ציפוי רטרוספקטיבית.
2. ללימודי קולוניזציה גית, 10 ⁹ תאים חיידקיים היו אוראליים ב100 μl לעכבר על ידי gavage, על שלושה ימים רצופים. רמות חיידקים commensal קיים ירדו בלפני ההאכלה על ידי תוספת של סטרפטומיצין 5 מ"ג / מ"ל במי שתייה בעכבר למשך 7 ימים שקדם לתחילת gavage פי ^1.

4. הדמית פליטת אור

1. 2D in vivo BLI ההדמיה בוצע באמצעות IVIS100 (Caliper). בממשל הגדיר נקודתי זמן הודעת חיידקים, עכברים היו מורדמים באמצעות ההרדמה של Caliper XGI-8 הגזמערכת עם Isofluorane 3%, וניתוח תמונה של כל גוף בוצעה ב100 מערכת IVIS עבור 2-5 דקות ברגישות גבוהה.
2. להדמית 3D, עכברים מורדמים הונחו במעבורת הדמית עכבר הפנימי של מערכת ההדמיה האופטית להדמיה הגבה (IVIS ספקטרום, Caliper). לרכוש תמונות של אות לוציפראז חיידקים לשיקום אופטי 3D, אורכי גל נעים סינון פליטה 500-580 ננומטר שמשו עם 16 פעמי רכישת הסל של 3-4 דקות למסנן למקסם את יחס האות לרעש. כחלק מרצף רכישת התמונה, תמונת אור מובנהית הושגה להגדיר מפת גובה. מפה זה הייתה קלט מפוזרת אור הדמית אלגוריתמי שחזורים ששמשו ליצירת תמונה אופטית 3D באמצעות אופטימיזציה אינה שלילית לפחות ריבועי ² טומוגרפיה (DLIT).
3. ניתוח תמונה: אזורים של עניין זוהה ולכמת באמצעות תוכנת תמונת חיים (Caliper).

5. נציגתוצאות

במחקר זה, החיידקים פתוגניים commensal הלא E.coli K-12 MG1655 להביע luxABCDE אופרון היה רביעי ניתן לעכברי נושאי גידולי xenograft 4T1 sc. לוקס אות חיידקים זוהתה באופן ספציפי בגידולים של עכברי הודעת IV-ממשל (איור 2). התאוששות תרבות של חיידקים מעכברי מדגם מאמתת את קיומו של קשר לינארי בין מספרי חיידקי קיימא וכמות האור זוהה (איור 3). בתחום הדמית vivo של חיידקי commensal דרך פה המנוהל ב- Git גם מושג באמצעות 3D BLI.

איור 1. פרוטוקול ציר זמן. גידולים תת עורי הם המושרה בעכברים, וחיידקים מנוהלים על התפתחות גידול (100 מ"מ ^3). עכברים חיים הם BLI imהבן בממשל שונה בזמן נקודתי הודעת חיידקים (חיצים להציג זמנים טיפוסיים).

איור 2. מנהל של E. MG1655 luxABCDE coli לעכברי נושאים גידולים. גידולים תת עורי 4T1 היה מושרה בMF1 נו / נו עכברים וא MG1655 luxABCDE coli מנוהל על התפתחות גידולים. כל חיה קבלה 10 ⁶ תאים הוזרקו ישירות לוריד הזנב לרוחב. עכברים צלמו בארבע נקודתי זמן במהלך המחקר (נקודות שחורות ציר Z-ותמונות) עם התאוששות מאוחרת של חיידקי קיימא (CFU) מגידולים של עכברים לדוגמה הקריבו (גרף עמודות). גידול במספרי חיידקים וביטוי גני פלסמיד במיוחד בגידולים נצפה לאורך זמן (עכבר נציג מאויר לכל נקודת זמן). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3. קשר בין מספרים חיידקיים intratumoral ופליטת אור. חיידקי קיימא בגידולים פורטו על ידי תרבות חיידקי vivo לשעבר מהגידולים הבאים לBLI בהודעת זמן נקודות שונים IV ממשל. היכנס ערכים של מספרי חיידקים (CFU) יחסית ליחידות vivo bioluminesce נמצאים בגרף. מתאם חזק בין ספירת חיידקים ואותות פליטת אור חיידקיים הוא ציין R ² = 0.9717 ^1.

איור 4. תמונת 3D IVIS של מערכת העיכול Murine מאוכלסת על ידי א coli MG1655. Git של עכברים היה קולוניה אוראלית של 10 ⁹ CFU של E. coli במשך שלושה ימים רצופים. דגימת תמונה בודדה מטומוגרפיה 3D של העכבר התנחל מוצגת.תמונות 3D להראות אטלס עכבר דיגיטלי של השלד לספק רישום אנטומי. א MG1655 פליטת אור coli גלויה בירוק בנמוך יותר, וסגולה ברמות גבוהות יותר.

Discussion

בהקשר של ריפוי גנטי, השימוש בחומרים ביולוגיים למסירה של גנים טיפוליים לחולים הוכיח הבטחה גדולה ^3-5. כמו וירוסים, התכונות הביולוגיות המולדות של חיידקים מאפשרות אספקה ​​יעילה DNA לתאים או רקמות, בעיקר בהקשר של הסרטן. הוכח שחיידקים באופן טבעי מסוגלים ביות לגידולים,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
שורת תאים 4T1	ATCC	CRL-2539	מודל סרטן השד Syngeneic נובע מגידול הנובע באופן ספונטני BALB / ג חלב
DMEM	סיגמה אולדריץ	D6429	הבינוני של Dulbecco השינוי של הנשר
PBS	סיגמה אולדריץ	D8537	נאגר מלוח פוספט
Xenogen IVIS	Caliper מדעי חיים		IVIS 100 עבור 2D הדמיה; ספקטרום IVIS 3D.
לוריא מרק מילר (LB)	סיגמה אולדריץ	L2542	מדיום גידול עבור E. coli
אריתרומיצין	סיגמה אולדריץ	E5389	אנטיביוטי
סטרפטומיצין	סיגמה אולדריץ	S9137	אנטיביוטי
עכברי MF1nu/nu	הרלן (בריטניה)	069 (נו) / 070 (נו / +)	HSD: Athymic עירום-Foxn1nu
עכברי BALB / ג	הרלן (בריטניה)	066	Haplotype: H-2 ד
מחט Gavage	וטרינר טק פתרונות (בריטניה)	DE009	22g x 38mm מחט gavage ישר
מזרק להזרקת IV	BD Biosciences	309309 - 1 מ"ל	מזרק אינסולין עם 28-G ½ מחט אינץ x מייקרו הקנס הרביעי.
מזרק לחיסון גידול	בראון	9161376V	Omnifix 26 x & Gfrac12; מחט אינץ