生物発光細菌のイメージング<emインビボで&gt;</em

要約

この記事はの管理について説明しルクスタグ付きマウスに細菌およびその後分析。

要約

このビデオでは、がんの遺伝子と細胞療法における細菌の使用に重点を置いて、生きたマウスにおける細菌人身売買の研究のための全身bioluminesceイメージング（BLI）の使用について説明します。細菌が全身投与後に腫瘍内に優先的に成長する天然の能力を有する、癌治療のためのベクターの魅力的なクラスを紹介します。細菌はバクテリアと同時に腫瘍部位のlux遺伝子カセット許可BLIの検出を発現するように設計。時間をかけて腫瘍内の場所や細菌のレベルを容易に調べることができ、2または3次元で可視化した。この方法は、細菌種と腫瘍異種移植片タイプの広い範囲に適用されます。この記事では、皮下腫瘍を有するマウス内生物発光細菌の分析のためのプロトコルについて説明します。 BLIによる胃腸管（GIT）内共生細菌の可視化についても説明しています。この強力な、そして安価、リアルタイムイメージング戦略representsのがん研究、特に遺伝子治療において、感染症の文脈におけるin vivoでの細菌の研究のための理想的な方法。このビデオでは、 ルクスタグ付きEを研究するための手順の概要を説明IVISシステムと空間的および時間的な読み出し達成可能な利用のBLIを示す生きたマウスで、 大腸菌 、。

プロトコル

1。腫瘍誘導

1. ルーチン腫瘍誘発については、無血清培地を200μlに懸濁された細胞の腫瘍形成性最小用量は、感染フリー6〜8週齢の雌BALB / cまたは無胸腺MF1-nu/nuマウスの脇腹に皮下（sc）注射したN = 21ゲージの注射針を用いて6（ハーラン、オックスフォード、英国）（1×10 ⁶ 4T1細胞）。血球計およびトリパンブルー色素排除（Gibco）を用いて、視覚カウントによって決定された接種に用いた細胞の生存率は95％以上であった。
2. 腫瘍確立後、腫瘍は成長と発展させ、そして週に2回モニターした。腫瘍体積は、腫瘍の最長径、b は直径と長径と直交する方向である式V =（AB ^2）Π/ 6によると、計算された。

2。細菌の準備

1. このprotocoで使用されて細菌の菌株lは、E.だっ細菌は、BLIによって検出することができるようになり、そのluxABCDEエンコードプラスミドを保持する大腸菌 K-12 MG1655、非タンパク質毒素発現株、。E.は統合luxABCDEを含むコリ MG1655は37で好気的に成長させた°LB培地のC（Sigma-Aldrich社、アイルランド）は300μg/ mlのエリスロマイシン（EM）を補充した。 MG1655の生物発光誘導体はプラスミドp16S ルクス構成のP _HELP luxABCDEオペロン^1が含まれ^ているを使用して作成しました。
2. マウスへの投与のための準備のために、培養物を中間対相（600nmでの光学密度）に200rpmで振とう機で37℃でLB培地中でインキュベートした。細菌は胃管栄養のための静脈内投与、または^1×10 10のために、（6000×gで5分間）遠心分離により回収し、PBS（Sigma）で洗浄し、PBSで希釈した1×10 ^7個のコロニー形成単位（CFU）/ mLであった。

3。細菌の管理者権限る

1. 腫瘍が体積で約100mm ^3に達したときにマウスを無作為に実験群に分けた。静脈内投与のためには、拘束されたマウスはそれぞれ28G注射針を使用して外側尾静脈に直接注入し、100μlの10 ^6個の細胞を受けた。各接種の生菌数は、回顧メッキによって決定された。
2. GITに植民地化研究のために、10 ⁹細菌細胞は、経口的に3日連続で、強制経口投与により、マウスあたり100μlで投与した。既存の共生細菌のレベルが前経口 ​​胃管栄養法の開始^1〜7日間マウスの飲料水の5 mg / mlのストレプトマイシンを添加することによって供給する前に減少した。

4。生物発光画像法

1. 生体 BLIイメージングの 2Dは​​IVIS100（キャリパー）を用いて行った。定義された時点ポスト細菌投与では、マウスはキャリパーのXGI-8ガス麻酔を使用して麻酔をかけた3％イソフルラン、および全身画像解析を使用したシステムは、高感度で2から5分間IVIS 100システムで行われた。
2. 3Dイメージングのために、麻酔したマウスは、背イメージング用光学イメージングシステム（IVISスペクトラム、キャリパー）の内側にマウスイメージングシャトルの中に置かれた。 3D光学復興のための細菌ルシフェラーゼ信号の画像を取得するには、500から580 nmの範囲で発光フィルターの波長は、信号対雑音比を最大にするためにフィルタごとに3〜4分のビン16アクイジション時間で使用されていました。この画像取得シーケンスの一部として、構造化された光像は高さマップを定義するために得られた。このマップは入力拡散光イメージング断層撮影（DLIT）非負最小二乗最適化^2を使用^して、3D光学像を形成するために使用された再構成アルゴリズムだった。
3. 画像解析：関心領域を特定し、リビングImageソフトウェア（キャリパー）を用いて定量した。

5。代表者結果

本研究では、非病原性の常在菌はluxABCDEオペロンを発現している大腸菌 K-12 MG1655はsc 4T1異種移植腫瘍を有するマウスに投与IVであった。細菌ルクス信号がマウスの腫瘍に特異的に検出された後のIV投与（ 図2）。サンプルマウス由来の細菌の培養の回復は生菌番号と検出された光の量（ 図3）との間に線形関係が存在することを検証します。GITに経口投与された共生細菌の in vivoイメージングでも3DのBLIを使用して達成される。

図1。プロトコルタイムライン 。皮下腫瘍をマウスで誘導し、細菌が、腫瘍の発達（100ミリメートル^3）によって管理されています。生きたマウスでは、BLIのイムアール様々な時間ポイント·ポスト細菌投与（矢印は、典型的な時刻を表示）で熟成。

図2。 Eの投与担癌マウスへのコリ MG1655 luxABCDE。4T1皮下腫瘍はMF1 nu / nuマウスとEに誘導されたコリ MG1655 luxABCDEは、腫瘍の開発時に投与した。各動物には外側尾静脈に直接注入10 ^6個の細胞を受けた。マウスはサンプル屠殺したマウスの腫瘍からの生菌のその後の回復（CFU）と一緒に勉強中の4時間点（黒丸z軸と画像）（棒グラフ）で撮像した。 （時点ごとに示す代表的なマウス）を経時的に観察された腫瘍に特異的に細菌数とプラスミド遺伝子発現の増加。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図3。腫瘍内細菌数および生物発光との関係。生菌は腫瘍では、様々な時間点ポストIV投与でBLIへの後続の腫瘍からex vivoで細菌培養によって列挙された。 生体 bioluminesce単位での相対的な細菌数の値（CFU）のログがグラフ表示されます。細菌数および細菌の生物発光信号間の強固な相関が観察され、R ² = 0.9717 ^1。

図4。マウス消化管の3D IVISイメージはE.によって植民地化コリ MG1655。マウスのGITは、E. 10 ⁹ cfuの経口投与によって植民地化された3日間連続して大腸菌 。植民地化されたマウスの3Dトモグラフィーから隔離されたサンプル画像が表示されます。3D画像は、解剖学的登録を提供するために、骨格のデジタルマウスアトラスを示しています。E.はコリ MG1655生物発光は、下位に ​​ある緑で表示され、より高いレベルで紫色です。

ディスカッション

遺伝子治療の文脈では、患者への治療遺伝子の送達のための生物学的製剤の使用は、非常に有望^3-5で示されている。ウイルスと同様に、細菌の生得的な生物学的特性は、特に癌の文脈では、細胞または組織への効率的なDNA送達を可能にする。これは、いずれかの外部（非侵襲種）または腫瘍細胞（病原体）内の、全身局所的に複製から高い評価を得て投与した場合、細菌は腫瘍にホ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	注釈
4T1細胞株	ATCC	CRL-2539	自然発生的に生じたBALB / c乳腺腫瘍由来同系乳癌モデル
DMEM	シグマアルドリッチ	D6429	ダルベッコ改変イーグル培地
PBS	シグマアルドリッチ	D8537	リン酸緩衝生理食塩水
Xenogen IVIS	キャリパーライフサイエンス		2DイメージングのためのIVIS 100; 3DのIVISスペクトラム。
ルリアブロスミラー（LB）	シグマアルドリッチ	L2542	大腸菌の増殖培地大腸菌の
エリスロマイシン	シグマアルドリッチ	E5389	抗生物質
ストレプトマイシン	シグマアルドリッチ	S9137	抗生物質
MF1nu/nuマウス	ハーラン（英国）	069（NU）/ 070（NU / +）	HSD：ヌード-Foxn1nu
Balb / cマウス	ハーラン（英国）	066	ハプロタイプH-2 D
強制飼養針	獣医ハイテクソリューションズ（英国）	DE009	22Gさx 38mmストレート強制飼養針
静脈注射用シリンジ	BD Biosciences社	309309〜1ミリリットル	28 G X½インチマイクロファインIVの針でインスリン注射器。
腫瘍接種用注射器	ブラウン	9161376V	Omnifix 26 G X＆frac12;インチ針