右心室收缩压测量组合在小鼠的肺和免疫组织样品的收获

摘要

一个特异，快速的协议，同时探讨合适的心脏功能，肺部炎症和免疫反应，被描述为一种学习工具。视频和数字，描述的生理和显微切割技术在组织团队的方法，是适用于用于小型到大型研究。

摘要

正确的心脏的功能是把血液通过肺部，从而将右心脏的生理和肺血管生理。炎症的心脏和肺的功能，是一种常见的改性剂，通过制定生产的细胞因子和生长因子，细胞浸润，并开始重塑过程^1。

右心室与左心室相比，是一个低压泵工作在一个相对窄的区域的压力变化。增加与肺动脉压力增加的压力在肺血管床和肺动脉高压^2。肺动脉高压往往伴有炎症性肺部疾病，如慢性阻塞性肺疾病，自身免疫性疾病^3。由于肺动脉高压赋予预后不良的生活质量和寿命，大量的研究是针对了解的机制，mig的HT药物干预^4的目标。有效的管理手段，为肺动脉高压的发展面临的主要挑战仍然是复杂的分子和细胞变化在权利的心，肺和免疫系统的同时了解。

在这里，我们提出了一个程序的工作流程，快速，精确的测量压力变化在正确的小鼠心脏的心脏，肺和免疫组织样本的同时收获。该方法是基于直接导管右心室，通过颈内静脉接近上身的小鼠，最早是在20世纪90年代后期，作为替代措施的压力在肺动脉^5-13。组织团队的方式有利于快速右心导管检查技术。这使得能够进行测量的小鼠的自发呼吸室内空气。在不同的工作领域的组织的工作流程减少了时间延迟和打开的可能性，同时进行生理实验和收获的免疫系统，心脏和肺组织。

这里列出的程序的工作流程，可以适应各种各样的实验室设置和研究设计，从小型的，有针对性的实验，到大型药物筛选试验。同时采集心肌的生理数据，可以扩展到包括超声心动图^5,14-17和收获的心脏，肺和免疫组织减少了需要获得数据的科学知识为基础向前移动的动物。这里介绍的程序的工作流程也提供了理想的基础免疫，肺和心脏功能的网络链接获取知识。这里概述的相同的原则可以适用于研究根据需要的其它的或附加的器官。

研究方案

1。准备

1. 准备以下的解决方案和管（ 表1）如下:
   1. Hanks溶液，无钙，镁或指示器，与青霉素（100单位/毫升）/链霉素（100毫克/毫升）。
   2. 磷酸盐缓冲盐水（PBS），1个，无钙，无镁。
   3. 乙醇，70％，500毫升。
   4. 与PBS缓冲甲醛，7％至10％，使500毫升。
   5. 麻醉科的解决方案:
      1. 圣阿韦坦。小心地加入2 - 甲基-2 - 丁醇的5毫升至5克的2,2,2 - 三溴乙醇。一旦溶解后，在室温下在黑暗中保持原液。以0.25毫升原液和稀释1xPBS在玻璃底瓶用10ml。包裹铝箔，地点的瓶在37℃下，直至溶解，然后等分试样分成5毫升的聚丙烯管中，并保存在冰箱中。温暖的一份日上午的实验。
      2. 巴比妥类药物。与PBS稀释原液2.6％巴比妥类溶胶ution。将聚丙烯管中的3-4毫升的等分试样。
2. 组织三个工作区（ 图1）。
3. 1. A区:安排以下项目:的的学习形式记录研究的识别号码，日期，体重，重量右心，左心和隔垫;精密刻度（0-50克精度0.01克），以确定身体的重量;微观尺度以确定的心脏重量精度0.001克的;称量皿;麻醉解决方案（清楚标明）;小杜瓦瓶用液氮;用冰冷的绝热容器;管和24孔板上，以收集血液和组织标本（ 表1）;外科手术器械（ 表2中，图2）;及清洁工具（ 表1）的解决方案。
   2. B区:安排以下项目:解剖显微镜，右心导管连接到放大器和笔记本电脑连接到压力控制单元。该导管被放置到含有水的烧杯中。安排手术器械（ 表2），最佳的长度，缝合切件，放入称重船磁带（高压釜磁带是最优的）削减到最佳的长度和宽度，为方便显微镜或实验室工作台一字排开;棉签头发卸妆液。在研究开始时，校准导管。
   3. C区:安排以下项目:放大镜镜片;气管插管; 1毫升注射器，缝合切到最佳长度，放入称重船小杜瓦瓶液氮;与冰的绝缘容器;管和24孔培养板，收集BAL和组织标本（ 表1）;外科手术器械（ 表2）;解决方案来执行BAL和，清洁气管插管和工具（ 表1）。

2。右心导管检查

1. 用一个精确的刻度称鼠标轻轻将鼠标移动到一个权衡b燕麦。请一定要轻轻地，悄悄地处理动物。记录重量。小鼠颈静脉的直径以容纳压力导管20克或更多，因为所描述的协议最适合静脉导尿较小的小鼠（17克或更多），只要是足够大的，它是可能的。
2. 麻醉鼠标通过注射圣阿韦坦取决于体重（10微升/克）， 例如用于20克给予200微升，25克给予250微升，30克给予300微升。的确切的注射体积取决于小鼠品系，需要进行调整。请一定要处理的动物，轻轻地，静静地，因为压力可以改变对麻醉剂的反应。
3. 鼠标后镇静剂，不醒人事，双折叠纸巾上。注意:在纸张上的ID号。脱毛乳液轻轻擦到腹侧方面的脖子上，以清除手术的领域。将鼠标在纸张上，等待1-2分钟。
4. 删除从腹侧方面​​的发头发对头发的生长方向，用棉签轻轻地抚摸着脖子上。
5. 请仔细确定足够的深度麻醉通过检查的脚趾反射的情况下，鼠标没有反应，捏脚趾。
6. 快速和轻松的工作环境的权利心脏导管插入术，其余应不超过10分钟，最佳3-6分钟。的组织，这是很重要的，因为不干燥导管需要滑行进入静脉和静脉内的水分的层上移动。一致的定时的过程中是很重要的的产生的数据组间可比性。
7. 将鼠标背部的纸巾，用纸巾转移到保丽龙板。修复的爪子和头，用高压釜磁带到位。
8. 切开皮肤，从下颚到胸骨（胸骨）。
9. 仔细解剖甲状腺隆重以上对下颌骨暴露右颈内静脉一第二气管。
10. 广场保丽龙板在解剖显微镜下按住鼠标聚焦平面在地方和镜头的约0.8倍的放大倍率（总放大倍率镜头所述目镜]约8倍。
11. 小心地除去周围结缔组织与手术镊子显微切割的右颈静脉。
12. 将两个件的缝合线的顶部的右颈静脉。领带最接近的下颌骨的缝合线，以关闭在静脉的血流量在一个狭小的涓流，放置在一个松散的结静脉周围的是最接近胸骨/乳房骨缝合线。一个可以使用的小滴的血在静脉孔后来发现，这应该成为必要。
13. 呼吸，放松放松颈部和下巴的肌肉，保持你的眼睛的静脉通过目镜上。这将确保你的手和手指移动安全，顺利和轻松。 ，虽然静脉用钳子在身边最亲近的下颌骨，到两者之间的缝合线用微型剪刀，用另一只手操作的静脉切开一个口子。放下手中的剪刀，并保持该手轻松，觉得自己的导管。轻轻检索拇指和食指（ 图3）之间的导管保持。将导管插入静脉的孔。
14. 轻轻推进右心导管插入（ 图3）。观察导管得到多远导管需要被插入的近似指数和观察显示器的标记。一旦压力曲线显示，轻轻地拧紧缝合导管周围。由于导管的抗张强度，给它一个线圈，因为鼠标的呼吸和心脏的跳动增加运动，另外用胶带固定导管。
15. 记录压力测量为供以后分析2分钟（ 图4）。
16. 打开导管缝合，然后轻轻地retrie已经导管。擦拭的部分的压力换能器的后面，将放入烧杯中，加水。请勿触摸压力传感器。
17. 将鼠标顶部纸巾上的区域A的安乐死，收集血液和脾组织。清洁手术器械。
18. 启动程序的下一个动物。当定时准许，在等待记录的压力曲线（2.15）注入麻醉。

3。的补血健脾样品收集

1. 注射巴比妥酸盐溶液，400μL每鼠标，等待1-2分钟。这是在我们的实验室进行例行避免，小鼠可能在不经意间恢复从阿佛丁麻醉而拖垮。实验是适当的标准化取得注入相同剂量每只小鼠巴比妥盐溶液，并通过等待相同数量的时间之前，血液收获。如果允许的实验动物护理和使用委员会和只要仔细地监测作为动物麻醉深度的前放血，这个步骤可以省略。
2. 切口进腹。打开尾静脉（腔静脉），用移液管收集血液。
3. 取出脾脏，脾进入Eppendorf管内，急速冷冻在液氮中的一块，或者进入到一个含有Hanks缓冲液后准备单细胞的24孔板。
4. 鼠标转移之上的薄纸收集BAL肺引流淋巴结，肺，心脏组织的工作区域C。清洁手术器械。

4。肺和心脏标本的收集

1. 解剖气管免费的肌肉和结缔组织。配售钳下的气管，拉缝合。轻轻产生足够的拉伸切开一个口子。保持温和的伸展，插入气管插管，用轻微的旋转运动，并缝合套管诠释Ø的地方。插入气管插管，气管确保湿润，如果有必要的Hanks液中加一滴。在整个过程中，呼吸，放松颈部和下巴的肌肉，保持手部动作的安全和顺畅。
2. 解剖开的肋骨，取出胸骨开始从腹部末端。 "请勿打扰"的胸部，因为这将使它很难找到淋巴结的内容。
3. 轻轻地插入Hanks缓冲液1毫升，进行支气管肺泡灌洗液（BAL），轻轻转动注射器和检索支气管肺泡灌洗液。重复3倍，接近管中，置于冰上。在整个手术过程中，保持眼睛的端部，连接到注射器的气管插管。一目了然的胸部，观察通货膨胀和通货紧缩的肺部。
4. 收获肺保持肋条笼形件的壁用一组镊子，寻找和检索与另一镊子的淋巴结的淋巴结。到24孔板的地点淋巴结。这是重要的为k现在要搜寻的位置:从颈部开始，找到从右侧的鼠标的肋条笼形件的入口，并期待脊柱以上（ 图5）。
5. 收获的心脏和纸巾。通过仔细解剖旁边的隔膜隔离的心。转移到工作区A称重，记录重量，并放入Eppendorf管在液氮中速冻。
6. 将关闭主支气管周围缝合，左肺叶。解剖左肺叶免费，自由的地方到eppendorf管中，急速冷冻于液氮中，或放入24孔板的井购买隔离的单细胞悬浮液中含有Hanks溶液。
7. 将约。 0.5毫升缓冲甲醛溶液通过气管插管到剩余的肺叶。通货膨胀后，解剖肺叶的胸部和地方50ml管中含有甲醛溶液。对于一个替代的研究设计，肺部可膨胀与优化正常切削媒体（OCT，用PBS稀释1:4）和在模具中未稀释的OCT冰冻切片后准备冻结。另一项研究设计可能需要获得快速冷冻和肺组织单细胞悬液从肺部。在这种情况下，没有通货膨胀是必要的:解剖其它肺叶;检索它们从成含有的Hanks缓冲液的24孔板的胸部和放入。
8. 取出气管插管，用Hanks缓冲液冲洗干净，清洁的手术器械。

5。右心导管产生的压力曲线分析

与没有知识中使用LabChart 7软件的组标识每个记录的记录的右心室压力数据进行分析。超过20条曲线被随机地选择和为每条曲线的最大和最小的心室压力之间的差异的测量（ΔP）。平均ΔP计算给右Ventricular收缩压。

结果

获得合适的心脏压力曲线的主要结果是通过合适的心脏导管的正确位置。右心室的导管内部的正确放置的压力时间曲线的形状是重要的，因为会导致压力高原（ 图4）。相反，高低不平的曲线，表明由呼吸或心脏跳动的运动靠在墙上的右心室导管移动。为了检测的阶段的动物的生存的潜在的问题，需要计算ΔP，和心脏的速度的标准偏差。预计这两个值都没有显着不同的治疗组之间。此...

讨论

此处列出的实验流程，允许快速和同时测量右心室收缩压和收获的样品分析的反应在肺部，心脏和免疫系统的小鼠。该过程结合心脏生理学测量，微解剖和随后的组织为活细胞研究，组织学分析，或组学分析的组织收获。的完整过程只需不到20分钟，每鼠标。由于工作区域组织的工作流程，2-3的动物可以同时进行研究。因此，程序是适用于小的，有针对性的实验¹²和设置在很宽的范围内进?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
名称	公司	目录编号	评论（可选）
			试剂
2 - 甲基-2 - 丁醇	Sigma-Aldrich公司	152463
2,2,2 - 三溴乙醇	Sigma-Aldrich公司	T48402
消毒肥皂（专题喷雾TB加STERIS）	Fisher Scientific则	1629至1608年
200的证明，乙醇，绝对无水ACS / USP级	PHARMCO-AAPER	111000200	用蒸馏水稀释至70％的
甲醛溶液	Sigma-Aldrich公司	F1635-500ML	稀释至7-10％，预计ldehyde浓度在PBS中浓度为1x使用PBS原液和水
Hanks溶液，无钙，镁	Fisher Scientific则	21-022-CV
OCT	组织康	4583
（10,000 U / ml）的青霉素/链霉素（10000毫克/毫升）解决方案	Thermo Scientific的	SV30010
磷酸盐缓冲盐水（PBS），无钙，无镁，1倍和10倍的解决方案	Fisher Scientific则
戊巴比妥钠26％	Fort Dodge动物保健	NDC 0856-0471-01
			医学实验
板12，24，96以及	鹰
移液管	Fisher Scientific则	13-711-9BM
管，EDTA涂层;	萨尔斯塔特	2013-08
管0.65毫升和1.7毫升的微离心	VWR
管12×75毫米聚丙烯	Fisher Scientific则	14-956-1D
管，各种大小，聚丙烯	Fisher Scientific则
			仪器
钳，DUMON第5精细	精细科学工具	11254-20
钳，超等格雷夫-0.5mm的技巧弯曲	精细科学工具	11152-10
钳，额外的网络连接东北格雷夫-0.5mm的提示直	精细科学工具	11150-10
19 GA 18GA，套管	BD	精密的滑翔针	切到最佳长度，减弱外嘶哑创建一个粗糙的外表面
剪刀，剪刀剥离超薄刀片9厘米	精细科学工具	14081-09
BAL，编织丝线缝合，缝合4-0	精细科学工具	SP116
缝合右心导管检查，编织丝线缝合，6-0	泰利福医疗	18020-60
注射器，1毫升	BD	309659
			设备
放大器，PowerLab系统4/30	ADInstrument	型号ML866
导管，压力F1.4	米勒仪器公司	840-6719
解剖显微镜	彩色摄影
钳，Vannas春风似剪刀毫米刀片	精细科学工具	15000-00
卤素照明台放大镜	Fisher Scientific则	11-990-56
笔记本电脑	华硕	型号A52F酷睿i5处理器，15英寸
光源	Amscope	HL-250-A
压力控制单元	米勒仪器公司	PCU-2000
软件，Labchart。亲V.7	AD在剂量率仪