肺およびマウスにおける免疫組織サンプルの収穫との組み合わせで右室収縮期圧測定

要約

同時に右心機能、肺の炎症、免疫応答を調査するために具体的かつ迅速なプロトコルが学習ツールとして記述されています。ビデオおよび図は大型の研究に小さなために使用されるのに適応され組織されたチーム·アプローチでは、生理学や顕微解剖の手法について説明します。

要約

右心の機能は、このように右心生理学と肺血管生理学をつなぐ、肺から血液を送り出す事である。炎症細胞浸潤は、サイトカインや成長因子の産生を起草によって、リモデリングプロセス^1を開始^することによって、心臓や肺の機能の一般的な修飾子です。

左心室に比べて、右心室は圧力変化の比較的狭いゾーンで動作する低圧ポンプです。増加した肺動脈圧、肺血管床および肺高血圧²の圧力の増加に関連付けられています。肺高血圧症は、多くの場合、炎症性肺疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患、または自己免疫疾患の³に関連付けられています。肺高血圧症は、生命と平均余命の質のための予後不良を与えるので、多くの研究がそのMIGメカニズムを理解に向けられているhtは、薬学的介入のための目標である^4。肺高血圧症のための効果的な管理ツールの開発のための主な課題は、右心、肺、免疫系の分子や細胞の変化の同時理解の複雑さのままです。

ここでは、マウスの右心内の圧力変化を迅速かつ正確に測定するための手続きのワークフローや心臓、肺、免疫組織からのサンプルの同時収穫を提示します。メソッドが最初に肺動脈^5-13の圧力の代理指標として、1990年代後半に開発されたクローズ胸マウスにおける頸静脈を介して右心室の直接カテーテル法に基づいています。主催チームのアプローチは非常に急速な右心カテーテル法を容易にします。これにより、自発的に部屋の空気を呼吸するマウスで測定を行うことができます。異なる作業領域で作業の流れの組織時間遅延を低減すると同時に、生理学実験や収穫免疫、心臓と肺の組織を実行する可能性を開きます。

ここで概説手続きワークフローが大きい薬剤スクリーニングアッセイには、小さなターゲットの実験から、実験室の設定や研究デザインの多種多様に適合させることができる。心エコー検査^5,14-17、心臓、肺、免疫組織の収穫を含むように拡張することができ、心臓の生理データの同時取得は、前方の科学的知識の基礎を移動するデータを取得するために必要な動物の数を減らすことができます。また、ここに提示され、手続きのワークフローは、免疫、肺や心臓の機能をリンクするネットワークの知識を得るための理想的な基盤を提供します。ここで概説同じ原則は、必要に応じて他のまたは追加の臓器を研究するために適合させることができます。

プロトコル

1。準備

1. 次のように以下の溶液とチューブを（ 表1）を準備します。
   1. ハンクス液、ペニシリン（100単位/ ml）/ストレプトマイシン（100 mg / ml）を持つ無カルシウム、マグネシウムまたはインジケータ。
   2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、1X、ノーカルシウム、マグネシウムをバッファリングしない。
   3. エタノール、70％、500ミリリットルを作る。
   4. PBSでホルムアルデヒド、7から10パーセントバッファ付き、500ミリリットルを作る。
   5. 麻酔ソリューション：
      1. AVERTIN。 2,2,2 - トリブロモ慎重5gに2 - メチル-2 - ブタノール5mlを加える。一度溶解し、暗所で室温の原液を保つ。ストック溶液0.25ミリリットルを取ると、ガラス底の瓶で1xPBS 10mlで薄め。 37℃アルミ箔、場所でボトルを包む℃で溶解し、次いで、アリコート5mlのポリプロピレンチューブに、冷蔵庫にキープまで。実験日の朝に1つのアリコートを温める。
      2. バルビツレート。 2.6パーセントのバルビツール酸ゾルを与えるためにPBSで原液を希釈しution。ポリプロピレン管3-4 mlのアリコートを置きます。
2. 3作業領域（ 図1）を整理します。
3. 1. 体重を決定するために、精密スケール（0.01 gの精度で0〜50グラム）、調査研究の識別番号を記録するための形式、日付、体重、右心、左心とセプタムの重みミクロスケールを：エリア：次の項目を並べ替える0.001グラムの精度で心の重みを判別するために、船の重量を量る。麻酔ソリューション（明らかにマークされている）、液体窒素を用いて小さなデュワー、氷と一緒に断熱容器、チューブ、24ウェルプレートの血液や組織標本（ 表1）を収集するために、手術器具（ 表2、図2）、楽器（ 表1）をきれいにするソリューションを提供しています。
   2. エリアB：解剖顕微鏡、アンプやラップトップコンピュータに接続された圧力制御ユニットに接続されている右心カテーテル：以下の項目を配置します。カテーテルは、内に配置される水を入れたビーカー。手術器具を（ 表2）を配置し、縫合糸の部分が最適な長さに切断し、重量を量るボートに入れ、テープ（オートクレーブテープが最適である）最適な長さと幅にカットして簡単にアクセスするための顕微鏡や実験室のベンチに並んで、綿棒と除毛·ソリューションを提供します。研究の開始時にカテーテルのキャリブレーションを行います。
   3. エリアC：は、気管カニューレ、1 mLシリンジ、縫合最適な長さにカットし、量るボートに入れ、液体窒素を持つ小さなデュワー、氷と一緒に断熱容器、チューブ、24ウェルプレートのBAL収集するためのルーペレンズ：以下の項目を配置しますおよび組織標本（ 表1）。手術器具（ 表2）;ソリューションは、BAL実行すると気管カニューレや楽器を（ 表1）きれいにする。

2。右心カテーテル検査

1. 優しく量るbにマウスを置くことによって、精度のスケールを使用して、マウスの重量を量る燕麦。ゆっくりと静かに動物を扱うようにしてください。重量を記録する。それは静脈の大きさが十分である限り小さいマウス（17グラム以上）カテーテルを挿入することが可能であり、頸静脈の直径は圧力カテーテルを収容しなければならないので、説明されたプロトコルは20グラム以上であるマウスに最適です。
2. 20グラムの25グラムが30グラム、300μlを与えるための250μlを、与えるために、200μlを与えるために、例えば体重（10μL/ g）を、に応じてAVERTIN注射でマウスをAnaesthetize。正確な注入量は、マウス系統に応じて調整する必要があります。ストレスが麻酔薬への応答を変更する可能性があるので、ゆっくりと静かに動物を扱うようにしてください。
3. ダブルプリーツティッシュペーパーの上にマウスを鎮静されたら、場所。紙の上にID番号をメモします。穏やかに手術野をクリアするために首の腹側面に脱毛ローションをこすります。紙の上に戻ってマウスを置き、1〜2分待つ。
4. 腹側面から髪を削除する優しく綿棒と髪の成長の方向に対して髪をなでることで首の。
5. 慎重につま先の反射の有無をチェックすることにより、麻酔の十分な深さを決定：マウスは、その足の指のピンチには反応しません。
6. 迅速かつリラックスした作業を、右心カテーテル検査の残りの部分では、最適に3から6分、10分以上を服用してはいけません。これは、カテーテルが静脈に滑ると水分の層の上に静脈の内側に移動する必要があるため、組織が乾燥しないことが重要である。手順の一貫したタイミングは、グループ間で比較可能であるデータの生成のために重要である。
7. 発泡スチロールの板の上にティッシュペーパーでティッシュペーパーや転送に戻っマウスを置きます。オートクレーブテープを使用して所定の場所に足と頭を修正しました。
8. あごから胸骨（胸の骨）への皮膚の切開を加えます。
9. 慎重に右頸静脈を露出させるために下顎骨に向かって甲状腺壮大上向きに解剖するND気管。
10. 約0.8倍の倍率（総合倍率[レンズXアイピース]で行われ、レンズにすでに焦点面で解剖顕微鏡下でマウスを保持する場所発泡スチロールのボードは、約8倍速です。
11. 慎重に手術鉗子で周囲の結合組織を除去することによって右頸静脈を顕微解剖。
12. 右頸静脈の上に縫合糸の2つのピースを置きます。小さな細流に静脈の血流を遮断するために顎骨に最も近い糸を結び、静脈の周りに緩い結び目で胸骨/胸の骨に最も近い糸を配置します。一つは、後で静脈に穴を見つけるために、血液の小さなしずくを使用することができ、これが必要になった。
13. 呼吸をして、リラックス（首と顎の筋肉を緩める）接眼レンズを通して静脈にあなたの目を維持する。これは、あなたの手や指がスムーズに、リラックスした、安全に移動するようになります。に最も近い側の鉗子で静脈を押さえながら下顎骨は、他の一方が運営するマイクロ剪刀を用いて2つの縫合の間に静脈に穴をあけます。マイクロはさみを置いて、その手に力を入れ、カテーテルのために感じる。優しく親指と人さし指（ 図3）との間でそれを保持し、カテーテルを取り出す。静脈の穴にカテーテルを挿入します。
14. 優しく右心（ 図3）にカテーテルを進める。カテーテルを挿入する必要があるどのくらいの近似インデックスを与えるとモニターを観察するカテーテルでマークを観察する。圧力曲線が表示されると、そっとカテーテルの周りに下糸を締​​めます。カテーテルはそれにコイルを与える引張強度を有しているので、マウスの呼吸と心臓の鼓動は、接辞付加的に、テープを使用してカテーテルをモーションを追加するためです。
15. 後で分析するために、2分間録音圧力測定（ 図4）。
16. カテーテルを保持している縫合糸を開き、そっとretrieカテーテルをVEの。圧力変換器の背後にある部分を拭き、水をビーカーに戻してください。圧力変換器には手を触れないでください。
17. 安楽死のための領域、血液および脾臓組織のコレクションにティッシュペーパーの上にマウスを移す。手術器具を清掃してください。
18. 次の動物を使ってプロシージャを起動します。圧力曲線（2.15）を記録するために待機している間にタイミングが許せば、麻酔薬を注入します。

3。血液および脾臓のサンプルの収集

1. 、ソリューションをバルビツレートマウス当たり400μlを注入し、1〜2分待つ。これは、日常的に出血している間マウスが不注意にAVERTIN麻酔から回復する可能性を避けるために、我々の研究室で行われます。実験の適切な標準化がマウス当たりバルビツール酸塩の溶液と同じ用量を注入し、血液の収穫前に、同じだけの時間が待っていることによって達成されます。インスティテューショナル·動物実験委員会が許可されている場合と限り動物が前に慎重瀉血に麻酔の深さのために監視されているように、この工程を省略することができる。
2. 腹部に切開を加えます。尾静脈（下大静脈）を開き、ホールピペットを用いて血液を収集します。
3. 脾臓を削除するか、またはエッペンドルフチュー​​ブと液体窒素中でスナップ凍結に脾臓の一部、または単一細胞の後の準備のためのよく含むハンクスバッファーに24ウェルプレートに。
4. BALのコレクション、肺所属リンパ節、肺、心臓組織のためのワークエリアCにティッシュペーパーの上にマウスを移す。手術器具を清掃してください。

4。肺や心臓のサンプルの収集

1. 筋肉や結合組織の気管自由を解剖。気管下に置く鉗子は、を通して縫合糸を引き出します。そっと穴をカットするのに十分なストレッチを生成します。穏やかな伸びを維持することは、わずかに回転運動を用いて気管カニューレを挿入し、縫合カニューレint型場所はO。ハンクス溶液の液滴を追加し、必要に応じて気管カニューレを挿入するために、気管が湿っていることを確認してください。手順では、手の動きが安全かつ円滑に保つために、首と顎の筋肉をリラックスして、呼吸する。
2. 慎重に腹部の端から始まる胸の骨を除去することによって胸郭を開いて解剖する。これは、それが非常に難しいリンパ節を見つけることになるため、胸部の内容を邪魔しないでください。
3. 優しくハンクス緩衝液1mlを挿入することによって、気管支肺胞洗浄（BAL）を行い、静かに注射器を回し、BAL液を取り出す。氷の上で3回、近くにチューブと場所を繰り返します。手順では、シリンジに接続し気管カニューレの端に目を保つ。肺の膨張と収縮を観察するために胸部に視線。
4. 別のピンセットでリンパ節を見つけて、検索、鉗子の1セットで胸郭壁を保持することによって、収穫肺リンパ節。 24ウェルプレートにリンパ節を置きます。これは、kに重要である今検索する場所：首から始めて、マウスの右側から胸郭の入り口を見つけると脊椎（ 図5）の上に見える。
5. ティッシュペーパーで収穫心臓と場所。慎重にセプタム並ん解剖によって右心を分離します。 、重さ、液体窒素中で凍結をスナップするエッペンドルフチュー​​ブに重量と場所を記録するための作業領域に転送する。
6. 主気管支を閉じるには、左肺の葉の周りに糸を置きます。エッペンドルフチュー​​ブおよび単一細胞懸濁液の後の単離のためにハンクス液を含む24ウェルプレートの各ウェルに液体窒素、または所定の位置にスナップ凍結に左肺葉無料、場所を解剖。
7. 約を挿入します。 0.5ミリリットル、残りの肺葉に気管カニューレを介してホルムアルデヒド緩衝溶液。膨張後、ホルムアルデヒド溶液を含む50 mlチューブに胸部と場所の肺葉を解剖する。代替研究デザインについては、肺が最適で膨らませることができるMALは、メディアをカットする（10月、PBSで1:4に希釈）、凍結切片の後の準備のために希釈されていない10月を含む金型内で凍結した。別の研究デザインは、スナップ凍結肺組織および肺からの単細胞懸濁液を得る必要とするかもしれない。その場合、どんなインフレは必要ありません：残り肺葉を解剖、よく含むハンクスバッファーに24ウェルプレートに胸部と場所からそれらを取得します。
8. ハンクス緩衝液を用いて洗浄することにより、クリーン気管カニューレを取り外し、手術器具を清掃してください。

5。右心カテーテルから発生する圧力曲線の解析

記録された右心室圧データは、各記録のグループのアイデンティティを知らない状態でLabChart 7ソフトウェアを用いて分析する。 20以上の曲線をランダムに選択し、各曲線の最大値と最小値の心室圧力差（ΔP）を測定する。平均ΔPを右vを与えるために計算されますentricular収縮期圧。

結果

右心圧カーブを得るための主要転帰は、右心カテーテルの正しい位置にすることによって達成される。右心室のカテーテル内部の正しい配置は圧力プラトー（ 図4）になりますので、圧力時間曲線の形状は非常に重要です。先端のとがった曲線は、代わりに、右心室の壁に呼吸や心臓の拍動によって移動されるカテーテルを示す。動物の生存の段階で潜在的な問題を検出するには...

ディスカッション

ここで概説した実験フローは肺、心臓およびマウスにおける免疫系の応答の分析のために右心室収縮期圧およびサンプルの収穫の迅速かつ同時測定を可能にします。手順は、心臓生理学測定、顕微解剖と生細胞研究、組織学的分析、または組織のオミクス解析のためのその後の組織の収穫を兼ね備えています。完全な手順については、マウス当たり未満20分かかります。仕事がないためにエ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
名前	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
			試薬
2 - メチル-2 - ブタノール	シグマアルドリッチ	152463
2,2,2 - トリブロム	シグマアルドリッチ	T48402
消毒石鹸（カバレッジスプレーTBプラスステリス）	フィッシャー·サイエンティフィック	1629年から1608年
エチルアルコール、200プルーフ、無水、絶対ACS / USPグレード	PHARMCO-AAPER	111000200	蒸留水で70％に希釈し、
ホルムアルデヒド溶液	シグマアルドリッチ	F1635-500ML	7から10までパーセントフォーマに希釈PBS原液と水を使用して1xのPBSの濃度でldehyde濃度
ハンクス液、無カルシウム、マグネシウム	フィッシャー·サイエンティフィック	21から022-CV
10月	組織 - Tek社	4583
ペニシリン（10,000 U / ml）を/ストレプトマイシン（10,000 mg / ml）のソリューション	サーモサイエンティフィック	SV30010
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、無カルシウム、マグネシウムなし、1xと10xの緩衝溶液	フィッシャー·サイエンティフィック
ペントバルビタールナトリウム26パーセント	フォートダッジ·アニマルヘルス	NDC 0856-0471-01
			実験機器
プレート12、24、96ウェル	ファルコン
トランスファーピペット	フィッシャー·サイエンティフィック	13から711-9BM
チューブは、EDTAコーティングされた	ザルスタット	2013から08
チューブ0.65ミリリットルと1.7ミリリットルマイクロ遠心	VWR
チューブ12×75mmのポリプロピレン	フィッシャー·サイエンティフィック	14から956-1D
チューブ、様々なサイズ、ポリプロピレン	フィッシャー·サイエンティフィック
			インスツルメンツ
鉗子、デュモン5位ファイン	ファイン科学ツール	11254から20
鉗子、湾曲極細グレーフェ-0.5ミリメートルのヒント	ファイン科学ツール	11152から10
鉗子、余分FiありNEグレーフェ-0.5ミリメートルヒントストレート	ファイン科学ツール	11150から10
カニューレ18GA、19 GA	BD	精度グライド針	、最適な長さに切断し平滑化し外粗い外表面を作成するためにrasped
はさみ、解剖用はさみスリムブレード9センチメートル	ファイン科学ツール	14081から09
BAL、編んだ絹縫合用の糸、4から0	ファイン科学ツール	SP116
右心カテーテル検査、編んだ絹縫合糸、6-0のための縫合	Teleflexは医療	18020から60
注射器、1ミリリットル	BD	309659
			機器
アンプ、PowerLabの4月30日	ADInstrument	モデルML866
カテーテル、圧力F1.4	ミラー·インスツルメンツ株式会社	840-6719
解剖顕微鏡	Variscope
鉗子、はさみVannas春〜2mmのブレード	ファイン科学ツール	15000から00
ハロゲンイルミネーションデスク拡大鏡	フィッシャー·サイエンティフィック	11-990-56
ラップトップコンピュータ	Asusの	モデル番号A52F i5プロセッサ、15インチ
光源	Amscope	HL-250-
圧力調整装置	ミラー·インスツルメンツ株式会社	PCU-2000
ソフトウェア、Labchart-ProのV.7	ADではインストゥルメント