Mesures systolique ventriculaire droite pression en combinaison avec la récolte du poumon et des échantillons de tissus immunitaires chez des souris

Résumé

Un protocole spécifique et rapide à la fois étudier la fonction cardiaque droite, une inflammation des poumons, et la réponse immunitaire est décrit comme un outil d'apprentissage. Vidéo et chiffres décrivent la physiologie et de techniques de microdissection dans une équipe organisée approche qui est adaptable pour être utilisé pour les petites et grandes études taille.

Résumé

La fonction du cœur droit est de pomper le sang à travers les poumons, reliant ainsi la physiologie du cœur droit et la physiologie vasculaire pulmonaire. L'inflammation est un modificateur de la commune fonctions cardiaques et pulmonaires, par l'élaboration d'une infiltration cellulaire, la production de cytokines et de facteurs de croissance, et en lançant des processus de remodelage ^1.

Par rapport au niveau du ventricule gauche, le ventricule droit est une pompe à basse pression qui fonctionne dans une zone relativement étroite de variations de pression. L'augmentation des pressions artérielles pulmonaires sont associés à une pression accrue dans le lit vasculaire pulmonaire et l'hypertension pulmonaire ^2. L'hypertension artérielle pulmonaire est souvent associée à des maladies pulmonaires inflammatoires, par exemple maladie pulmonaire obstructive chronique, maladies auto-immunes ou ^3. Parce que l'hypertension artérielle pulmonaire confère un mauvais pronostic pour la qualité de vie et l'espérance de vie, beaucoup de recherches sont orientées vers la compréhension des mécanismes qui might être la cible de ⁴ intervention pharmaceutique. Le principal défi pour le développement d'outils de gestion efficaces pour l'hypertension pulmonaire reste la complexité de la compréhension simultanée des changements moléculaires et cellulaires dans le cœur droit, les poumons et le système immunitaire.

Ici, nous présentons un workflow procédural pour la mesure rapide et précise des variations de pression dans le cœur droit de la souris et la récolte simultanée des échantillons de cœur, les poumons et les tissus immunitaires. La méthode est basée sur le cathétérisme directe du ventricule droit par la veine jugulaire en gros torse souris, d'abord développé dans les années 1990 comme mesure de substitution de pressions dans l'artère pulmonaire ^5-13. L'équipe a organisé approche facilite une technique très rapide cathétérisme cardiaque droit. Cela permet d'effectuer les mesures sur des souris qui respirent spontanément l'air ambiant. L'organisation du flux de travail dans les différents domaines de travail-réduit le délai du temps et ouvre la possibilité d'effectuer simultanément des expériences de physiologie et de la récolte des tissus immunitaire, cardiaques et pulmonaires.

Le workflow procédural décrit ici peut être adapté à une grande variété de paramètres de laboratoire et des plans d'étude, des petits, des expériences ciblées, aux grands tests de dépistage de drogue. L'acquisition simultanée de données physiologie cardiaque qui peut être élargi pour inclure l'échocardiographie ^5,14-17 et la récolte des tissus cardiaques, pulmonaires et du système immunitaire réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des données qui déplacent la base des connaissances scientifiques vers l'avant. Le workflow procédural présentée ici fournit également une base idéale pour acquérir des connaissances sur les réseaux qui relient immunitaire, pulmonaire et la fonction cardiaque. Les mêmes principes décrits ici peuvent être adaptées pour étudier d'autres organes ou supplémentaires, au besoin.

Protocole

1. Préparation

1. Préparer les solutions suivantes et tubes (tableau 1) comme suit:
   1. Écheveaux solution, pas de calcium, de magnésium ou de l'indicateur avec de la pénicilline (100 U / ml) / streptomycine (100 mg / ml).
   2. Tampon phosphate salin (PBS), 1x, pas de calcium, de magnésium aucune.
   3. Éthanol, 70%, faire 500 ml.
   4. Tamponnée de formaldéhyde, de 7-10% avec du PBS, faire 500 ml.
   5. Solutions d'anesthésie:
      1. Avertin. Ajouter avec précaution 5 ml de 2-méthyl-2-butanol à 5 ​​g de 2,2,2-tribromoéthanol. Une fois dissous, gardez solution mère à la température ambiante dans l'obscurité. Prenez 0,25 ml de la solution mère et le diluer avec 10 ml d'1xPBS en bouteille à fond de verre. Envelopper la bouteille avec du papier d'aluminium, placer à 37 ° C jusqu'à dissolution, puis aliquote dans des tubes de 5 ml en polypropylène et conserver au réfrigérateur. Chauffez une aliquote du matin de l'expérience.
      2. Barbituriques. Diluer la solution mère avec du PBS pour donner 2,6% barbiturique solution. Placez aliquotes 3-4 ml dans des tubes en polypropylène.
2. Organiser trois travaux-zones (figure 1).
3. 1. Zone A: Disposer les éléments suivants: Formulaire étude pour enregistrer le numéro d'identification étude, la date, le poids corporel, le poids du coeur droit, le coeur gauche et du septum, une balance de précision (0-50 g à 0,01 g de précision) pour déterminer le poids du corps; micro-échelle pour déterminer le poids du cœur à 0,001 g de précision; pèsent bateaux, les solutions d'anesthésie (clairement identifiés), petit vase de Dewar d'azote liquide; conteneur isotherme avec de la glace, tubes et plaques à 24 puits pour recueillir des échantillons de sang et de tissus (tableau 1); instruments chirurgicaux ( Le tableau 2, figure 2), et les solutions pour nettoyer les instruments (tableau 1).
   2. Zone B: Disposez les articles suivants: microscope de dissection; cathéter cardiaque droite relié à une unité de contrôle de la pression qui est connecté à un amplificateur et un ordinateur portable. Le cathéter est placé dansun bécher contenant de l'eau. Disposer les instruments chirurgicaux (tableau 2), des morceaux de coupe de suture à la longueur optimale et placés dans un bateau pèse; ruban (ruban autoclave est optimale) coupé à la longueur et la largeur optimale et alignés sur le banc microscope ou au laboratoire pour un accès facile, des cotons-tiges et Epilateur solution. Étalonner le cathéter au début de l'étude.
   3. Zone C: Disposez les éléments suivants: lentilles loupe; canule trachéale; seringues de 1 ml; coupe de suture à la longueur optimale et placé dans un bateau peser, petit vase de Dewar d'azote liquide; conteneur isotherme avec de la glace, tubes et plaques à 24 puits pour recueillir BAL et des échantillons de tissus (tableau 1), les instruments chirurgicaux (tableau 2), des solutions pour effectuer BAL et à nettoyer la canule trachéale et les instruments (tableau 1).

2. Cathétérisme cardiaque droit

1. Peser souris à l'aide d'une balance de précision en plaçant délicatement la souris dans une pesée bd'avoine. Assurez-vous de traiter l'animal en douceur et en silence. Notez le poids. Le protocole décrit fonctionne le mieux pour les souris qui sont de 20 g ou plus parce que le diamètre de la veine jugulaire doit accueillir le cathéter de pression, il est possible de sonder les petites souris (17 g ou plus) tant que la veine est assez grand.
2. Anesthésier la souris par injection avec Avertin en fonction du poids corporel (10 ul / g), par exemple pour donner 20 g 200 pi, pour donner 25 g 250 pi, pour donner 30 g 300 pl. Le volume d'injection exacte doit être ajustée en fonction de la souche de souris. Assurez-vous de traiter l'animal en douceur et en silence car le stress peut modifier la réponse à l'anesthésie.
3. Une fois que la souris est sous sédatif, les placer sur du papier de soie plissé double. Notez le numéro d'identification sur le papier. Frottez doucement la lotion épilation à la face ventrale du cou pour dégager le champ opératoire. Placez la souris en arrière sur le papier et attendre pendant 1-2 min.
4. Enlever les poils de la face ventraledu col par caressant doucement les cheveux dans le sens de la pousse des cheveux avec des cotons-tiges.
5. Soin de déterminer la profondeur de l'anesthésie suffisante en vérifiant l'absence du réflexe de pointe: la souris ne réagit pas au pincement de ses orteils.
6. En travaillant rapidement et détendue, le reste de l'cathétérisme cardiaque droit ne devrait pas prendre plus de 10 minutes, de façon optimale 3-6 min. Il est important que le tissu ne se dessèche pas parce que le cathéter doit glisser dans la veine et se déplacent à l'intérieur de la veine sur une couche d'humidité. Conformément moment de la procédure est importante pour la production de données qui soient comparables entre les groupes.
7. Placez la souris sur le dos du papier de soie et de transfert de papier tissu sur mousse de polystyrène bord. Fixer les pattes et la tête en place avec du ruban autoclave.
8. Faire une incision de la peau de mandibules au sternum (sternum).
9. Disséquer soigneusement vers le haut thyroïde grands vers les mandibules pour exposer la veine jugulaire droite une trachée.
10. Lieu polystyrène conseil d'administration en tenant la souris sous le microscope de dissection avec le plan focal déjà en place et la lentille à environ 0,8 x grossissement (grossissement total [pièce cristallin x] est d'environ 8x.
11. Soigneusement microdissect la veine jugulaire droite en enlevant entourant le tissu conjonctif avec des pinces chirurgicales.
12. Placez deux morceaux de suture au-dessus de la veine jugulaire droite. Attacher le fil de suture proche de la mandibule pour fermer le débit sanguin dans la veine d'un nombre très limité, de placer le fil de suture qui est plus proche de la poitrine / sternum à un noeud lâche autour de la veine. On peut utiliser le mince filet de sang pour trouver plus tard le trou dans la veine, si cela s'avérait nécessaire.
13. Respirez et détendez-vous (desserrer les muscles du cou et de la mâchoire) pour garder vos yeux sur la veine à travers l'oculaire. Cela permettra d'assurer que vos mains et vos doigts se déplacer en toute sécurité, facilement et détendue. Tout en maintenant la veine avec une pince sur le côté le plus proche deles mandibules, découper un trou dans la veine entre les deux points de suture à l'aide de micro-ciseaux exploités par l'autre main. Déposez les ciseaux micro-, et de garder la main détendue que, pour sentir le cathéter. Doucement récupérer le cathéter en le tenant entre le pouce et l'index (Figure 3). Insérer le cathéter dans l'orifice de la veine.
14. Avancer doucement le cathéter dans le coeur droit (figure 3). Observer les marques au cathéter qui donne un indice approximatif de la distance du cathéter doit être inséré et observer le moniteur. Une fois les courbes de pression sont affichées, serrez délicatement la partie inférieure de suture autour du cathéter. Parce que le cathéter a résistance à la traction qui lui donne une bobine, et parce que le rythme respiratoire et cardiaque de la souris ajouter du mouvement, en outre fixer le cathéter avec du ruban adhésif.
15. Mesures de pression records pendant 2 minutes pour une analyse ultérieure (Figure 4).
16. Ouvrez le support de suture du cathéter, puis doucement Retrieve cathéter. Essuyez la partie arrière du transducteur de pression, replacez-le dans le bol avec de l'eau. Ne touchez pas le capteur de pression.
17. Transfert de la souris au-dessus du papier de soie à la zone A pour l'euthanasie, la collecte de sang et le tissu splénique. Nettoyer les instruments chirurgicaux.
18. Démarrez la procédure avec l'animal suivant. Lorsque la synchronisation permet, injecter l'anesthésique dans l'attente d'enregistrer la courbe de pression (2,15).

3. Prélèvement des échantillons de sang et la rate

1. Injecter barbituriques solution, 400 pi par souris et attendre pendant 1-2 min. Ceci est habituellement effectué dans notre laboratoire afin d'éviter la possibilité que les souris par inadvertance se remettre de l'anesthésie-avertin tout en étant saigné. Normalisation appropriée de l'expérience est réalisée en injectant la même dose de barbiturique solution par souris, et en attendant la même quantité de temps avant la récolte du sang. Si elle est autorisée par la protection des animaux et institutionnel Utiliser Comité etaussi longtemps que les animaux sont suivis pendant la profondeur de l'anesthésie avant la saignée, cette étape peut être omise.
2. Faire une incision dans l'abdomen. Ouvrez la veine caudale (la veine cave) et recueillir le sang à l'aide d'une pipette de transfert.
3. Ablation de la rate, ou un morceau de la rate dans le tube Eppendorf et refroidissement rapide dans l'azote liquide, ou dans la plaque à 24 puits dans un tampon contenant bien Hanks pour la préparation ultérieure de cellules individuelles.
4. Transfert de la souris au-dessus du papier de soie pour le travail et la zone C pour la collecte des BAL, les ganglions lymphatiques drainant poumon, le poumon et les tissus cardiaques. Nettoyer les instruments chirurgicaux.

4. Collecte des échantillons du poumon et coeur

1. Disséquer la trachée libre de muscle et de tissu conjonctif. Pince placement sous la trachée, tirez suture à travers. Doucement générer suffisamment extensible pour couper un trou. Maintenir l'étirement doux, insérer la canule trachéale en utilisant un mouvement tournant légèrement, et la suture canule into lieu. Pour l'insertion de la canule trachéale, assurez-vous que la trachée est humide, si nécessaire, ajouter une goutte de solution de Hanks. Tout au long de la procédure, respirer, se détendre le cou et les muscles de la mâchoire, de garder mouvements de la main sûre et en douceur.
2. Disséquer ouvrir la cage thoracique en retirant avec précaution le sternum à partir de l'extrémité abdominale. Ne pas déranger le contenu du thorax car cela rendra très difficile de trouver le ganglion lymphatique.
3. Effectuer lavage broncho-alvéolaire (LBA) en insérant doucement 1 ml de tampon de Hanks, tournez doucement la seringue et récupérer le liquide de LBA. Répétez 3 fois, tube étroit et place sur la glace. Tout au long de la procédure, garder les yeux sur l'extrémité de la canule trachéale qui se connecte à la seringue. Coup d'œil sur le thorax d'observer l'inflation et la déflation des poumons.
4. Ganglion lymphatique récolte du poumon en maintenant paroi de la cage thoracique d'un jeu de pinces, la recherche et la récupération des ganglions lymphatiques avec une autre pince. Ganglions lymphatiques lieu en plaque à 24 puits. Il est important de kmaintenant où chercher: à partir de la nuque, trouver l'entrée de la cage thoracique du côté droit de la souris et regarder au-dessus de la colonne vertébrale (figure 5).
5. Coeur de récolte et les placer sur du papier de soie. Isoler le cœur droit en prenant soin de dissection le long de la cloison. Transfert à l'aire de travail de A à peser, enregistrer le poids et la place dans des tubes Eppendorf de casser le gel dans l'azote liquide.
6. Placez suture autour du lobe pulmonaire gauche pour fermer la bronche principale. Disséquer le poumon gauche lobe libre, le placer dans tube Eppendorf et refroidissement rapide dans l'azote liquide, ou le placer dans un puits d'une plaque à 24 puits contenant la solution de Hanks pour l'isolation ultérieure de suspensions de cellules isolées.
7. Insérez env. 0,5 ml solution tamponnée de formaldéhyde par la canule trachéale dans les lobes pulmonaires restantes. Après l'inflation, disséquer les lobes pulmonaires sur le thorax et le placer dans tube de 50 ml contenant une solution de formaldéhyde. Pour une conception de l'étude alternative, les poumons peuvent être gonflés à l'optimal la coupe des médias (PTOM, dilué 1:4 avec du PBS) et congelés dans un moule contenant octobre non dilués pour la préparation ultérieure de coupes congelées. Une autre conception de l'étude pourrait nécessiter l'obtention de tissus pulmonaires pression congelés et des suspensions monocellulaires dans les poumons. Dans ce cas, pas d'inflation est nécessaire: disséquer les lobes pulmonaires restantes; les récupérer depuis le thorax et le placer dans la plaque de 24 puits dans un tampon contenant bien Hanks.
8. Retirer la canule trachéale, le rincer avec du tampon de Hanks, nettoyer les instruments chirurgicaux.

5. L'analyse des courbes de pression générées à partir du cathéter cardiaque droite

Les données enregistrées pression ventriculaire droite sont analysés en utilisant LabChart 7 du logiciel sans aucune connaissance de l'identité du groupe de chaque enregistrement. Plus de 20 courbes sont sélectionnées de manière aléatoire et la différence entre le maximum et le minimum de pression ventriculaire pour chaque courbe de mesure (AP). L'AP moyenne est calculée pour donner le droit de vpression systolique entricular.

Résultats

Le paramètre principal pour obtenir les courbes de pression droite du coeur est obtenue par la position correcte du cathéter cardiaque droite. La forme des courbes de temps de pression est essentielle, car le placement correct de l'intérieur du cathéter du ventricule droit se traduira par des plateaux de pression (figure 4). Courbes pointues, au contraire, indiquent un cathéter qui est déplacé par la respiration ou du rythme cardiaque mouvement contre la paroi du ventricule droit. Pour détec...

Discussion

Le flux expérimentale décrite ici permet une mesure rapide et simultanée de la pression systolique ventriculaire droite et la récolte d'échantillons pour l'analyse des réponses dans les poumons, le cœur et le système immunitaire chez la souris. La procédure combine des mesures de la physiologie cardiaque, micro-dissection des tissus et la récolte ultérieure pour les études de cellules vivantes, l'analyse histologique ou omiques-analyse des tissus. La procédure complète prend moins de 20 minutes...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
			Réactifs
2-méthyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463
2,2,2-tribromoéthanol	Sigma-Aldrich	T48402
savon désinfectant (couverture uniforme tuberculose ainsi Steris)	Fisher Scientific	1629-1608
Alcool éthylique, 200 Proof, absolu, anhydre ACS / USP grade	Pharmco-AAPER	111000200	Diluer à 70% avec de l'eau distillée
Solution de formaldéhyde	Sigma-Aldrich	F1635-500ML	Diluer à un 7-10% formaconcentration ldehyde PBS à une concentration de 1 x PBS en utilisant la solution mère et de l'eau
Hanks solution, pas de calcium, de magnésium	Fisher Scientific	21-022-CV
Octobre	Tissue-Tek	4583
Pénicilline (10.000 U / ml) / streptomycine (10.000 mg / ml)	Thermo Scientific	SV30010
Tampon phosphate salin (PBS), pas de calcium, de magnésium aucune des solutions 1x et 10x	Fisher Scientific
Le pentobarbital sodique 26%	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-0471-01
			Labware
Les plaques 12, 24, 96 et	Faucon
Pipeter transfert	Fisher Scientific	13-711 9BM-
Tube, EDTA couché	Sarstedt	2013-08
Tubes de 0,65 ml et 1,7 ml de micro-centrifugeuse	VWR
Polypropylène tubes 12 x 75 mm	Fisher Scientific	14 à 956-1D
Tubes en polypropylène de différentes tailles,	Fisher Scientific
			Instruments
Forceps, Dumon # 5 Beaux-	Outils Fine Science	11254-20
Forceps, extra fine 0,5 mm graefe-conseils courbé	Outils Fine Science	11152-10
Forceps, extra fine Graefe-0.5mm conseils droite	Outils Fine Science	11150-10
Canule calibre 18, 19 ga	BD	Precision Aiguilles Glide	Couper à la longueur optimale, émoussé et à l'extérieur râpé pour créer une surface rugueuse à l'extérieur
Ciseaux, ciseaux de dissection fines lames-9cm	Outils Fine Science	14081-09
Suture pour BAL, une suture de soie tressée, 4-0	Outils Fine Science	SP116
Suture de cathétérisme cardiaque droit, suture de soie tressée, 6-0	Teleflex Medical	18020-60
Seringue de 1 ml	BD	309659
			Équipement
Amplificateur, PowerLab 4/30	ADInstrument	Modèle ML866
Cathéter, la pression F1.4	Millar Instruments, Inc	840-6719
Microscope à dissection	Variscope
Forceps, ciseaux Vannas printemps-2mm lames	Outils Fine Science	15000-00
Loupe éclairante halogène bureau	Fisher Scientific	11-990-56
Ordinateur portable	Asus	Numéro de modèle A52F processeur i5, 15 pouces
Source de lumière	Amscope	HL-250-A
Unité de contrôle de pression	Millar Instruments, Inc	PCU-2000
Logiciel, LabChart-Pro V.7	Dans ADinstruments