Правого желудочка систолическое давление измерений в сочетании с Harvest легких и иммунной образцы тканей у мышей

Wen-Chi Chen; Sung-Hyun Park; Carol Hoffman; Cecil Philip; Linda Robinson; James West; Gabriele Grunig

doi:10.3791/50023

АВТОРЫ

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Method Article

Правого желудочка систолическое давление измерений в сочетании с Harvest легких и иммунной образцы тканей у мышей

DOI:

10.3791/50023

⸱

January 16th, 2013

Wen-Chi Chen*¹, Sung-Hyun Park*¹, Carol Hoffman¹, Cecil Philip¹, Linda Robinson², James West², Gabriele Grunig¹^,³

¹Department of Environmental Medicine, New York University School of Medicine, Tuxedo, ²Division of Allergy, Pulmonary, & Critical Care Medicine, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, ³Division of Pulmonary Medicine, New York University School of Medicine

* Эти авторы внесли равный вклад

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Резюме

Конкретных и быстрых протоколов одновременно исследовать функцию правого сердца, воспаление легких, и иммунный ответ описывается как инструмент обучения. Видео и цифры описывают физиологию и микродиссекции методы в организованном командой подход, который адаптирован для использования в малых и больших размеров исследований.

Аннотация

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is a common modifier of heart and lung function, by elaborating cellular infiltration, production of cytokines and growth factors, and by initiating remodeling processes ¹.

Compared to the left ventricle, the right ventricle is a low-pressure pump that operates in a relatively narrow zone of pressure changes. Increased pulmonary artery pressures are associated with increased pressure in the lung vascular bed and pulmonary hypertension ². Pulmonary hypertension is often associated with inflammatory lung diseases, for example chronic obstructive pulmonary disease, or autoimmune diseases ³. Because pulmonary hypertension confers a bad prognosis for quality of life and life expectancy, much research is directed towards understanding the mechanisms that might be targets for pharmaceutical intervention ⁴. The main challenge for the development of effective management tools for pulmonary hypertension remains the complexity of the simultaneous understanding of molecular and cellular changes in the right heart, the lungs and the immune system.

Here, we present a procedural workflow for the rapid and precise measurement of pressure changes in the right heart of mice and the simultaneous harvest of samples from heart, lungs and immune tissues. The method is based on the direct catheterization of the right ventricle via the jugular vein in close-chested mice, first developed in the late 1990s as surrogate measure of pressures in the pulmonary artery^5-13. The organized team-approach facilitates a very rapid right heart catheterization technique. This makes it possible to perform the measurements in mice that spontaneously breathe room air. The organization of the work-flow in distinct work-areas reduces time delay and opens the possibility to simultaneously perform physiology experiments and harvest immune, heart and lung tissues.

The procedural workflow outlined here can be adapted for a wide variety of laboratory settings and study designs, from small, targeted experiments, to large drug screening assays. The simultaneous acquisition of cardiac physiology data that can be expanded to include echocardiography^5,14-17 and harvest of heart, lung and immune tissues reduces the number of animals needed to obtain data that move the scientific knowledge basis forward. The procedural workflow presented here also provides an ideal basis for gaining knowledge of the networks that link immune, lung and heart function. The same principles outlined here can be adapted to study other or additional organs as needed.

протокол

1. Подготовка

Подготовьте следующие решения и трубы (таблица 1) следующим образом:
1. Хэнкс решение, не кальций, магний или индикатора с пенициллина (100 ЕД / мл) / стрептомицин (100 мкг / мл).
2. Фосфатным буферным раствором (PBS), 1x, ни кальций, ни магний.
3. Этанол, 70%, составит 500 мл.
4. Buffered формальдегида, 7-10% с PBS, составит 500 мл.
5. Анестезия решения:
  1. Avertin. Осторожно добавьте 5 мл 2-метил-2-бутанол до 5 г 2,2,2-Tribromoethanol. После растворения, держать раствор при комнатной температуре в темноте. Возьмите 0,25 мл раствора и разбавить его с 10 мл 1xPBS в стеклянной бутылке дно. Заверните бутылку с алюминиевой фольгой, место при 37 ° С до полного растворения, а затем аликвоты в 5 мл пробирок из полипропилена и хранить в холодильнике. Теплый аликвоты утром эксперимента.
  2. Барбитуратов. Разбавить раствор с PBS, чтобы дать 2,6% барбитуратов зольution. Поместите 3-4 мл аликвоты в полипропиленовых труб.
Организовать три рабочих областей (рис. 1).
1. Площадь: организовать следующие элементы: исследование форм для записи исследования идентификационный номер, дата, вес тела, вес правого сердца, левого желудочка и перегородки; точность шкалы (0-50 г на уровне 0,01 точностью г) для определения массы тела; микроуровне для определения веса сердца на уровне 0,001 точности г, вес лодки; анестезии решений (четко обозначены); небольшой сосуд Дьюара с жидким азотом; изолированный контейнер со льдом, трубы и 24-луночный планшет для сбора крови и образцах тканей (табл. 1); хирургические инструменты ( Таблица 2, Рисунок 2), а также решения для очистки инструментов (табл. 1).
2. Зона B: организовать следующие пункты: рассекает микроскопом; право катетером сердце соединено с блоком контроля давления, подключенный к усилителю и портативный компьютер. Катетер встакан с водой. Организовать хирургических инструментов (Таблица 2), части шва путь к оптимальной длины и помещают в лодку весом; ленты (автоклав ленту оптимальной) сократить до оптимальной длины и ширины и выстроились на скамейке микроскопа или лабораторию для легкого доступа; ватные тампоны и Решение для удаления волос. Калибровка катетера в начале исследования.
3. Зона C: организовать следующие пункты: лупа линзы; трахеи канюли, 1 шприц мл; шовный путь к оптимальной длины и помещают в лодку весом, небольшой сосуд Дьюара с жидким азотом; изолированный контейнер со льдом, трубы и 24-луночный планшет для сбора BAL и образцов тканей (табл. 1); хирургических инструментов (Таблица 2); решения для выполнения BAL и для очистки трахеи канюли и инструменты (табл. 1).

2. Катетеризация правых отделов сердца

Взвешивание мыши с помощью точных масштабах, осторожно размещения мыши в весят бовса. Убедитесь, что справиться с животным мягко и спокойно. Запись веса. Описанный протокол работает лучше всего для мышей, 20 г или более, поскольку диаметр яремной вены должен разместиться давления катетер, можно катетеризации меньше мышей (17 г или больше), пока вены достаточно велик.
Анестезию мыши путем инъекции Avertin в зависимости от веса тела (10 мкл / г), например, для 20 г дают 200 мкл, для 25 г дают 250 мкл, для 30 г дают 300 мкл. Точный объем инъекции должна быть скорректирована в зависимости от мышей штамма. Убедитесь, что справиться с животным мягко и тихо, потому что стресс может изменить ответ на анестезию.
Как только мышь в отключке, место на двойной гофрированной бумагой. Обратите внимание на ID номер на бумаге. Аккуратно протрите лосьоном удаления волос в вентральной части шеи, чтобы очистить операционного поля. Наведите обратно на бумагу и подождать 1-2 мин.
Удалить волосы из вентральнойчасть шеи, осторожно поглаживая волосы против направления роста волос с ватные тампоны.
Тщательно определить достаточную глубину анестезии, проверяя отсутствие ног рефлекс: мышь не реагирует на ущемление своих пальцах.
Рабочие быстро и спокойно, оставшаяся часть катетеризации правых отделов сердца не должна длиться более 10 минут, оптимально 3-6 мин. Важно, чтобы ткань не высыхает, потому что катетер должна скользить в вену и двигаться внутри вены на слой влаги. В соответствии сроки процедура важна для получения данных, которые сопоставимы между группами.
Место мыши обратно на бумаге, ткани и ткани с передачей бумаги на пенополистирол платы. Исправить лапы и голова на месте с помощью автоклава ленты.
Сделайте надрез кожи от челюсти до грудины (грудной кости).
Осторожно рассекают щитовидной железы великого вверх к челюсти, чтобы выставить правую яремную венуй трахеи.
Место пенополистирола платы удерживая кнопку мыши под микроскопом рассечение с фокальной плоскости уже на месте и объектива приблизительно 0,8 x увеличение (общее увеличение [х линз окуляра] примерно 8x.
Осторожно microdissect правую яремную вену, удалив окружающей соединительной ткани с хирургическими щипцами.
Место две части шва на верхней части правой яремной вены. Привяжите нить ближе к челюсти, чтобы закрыть поток крови в вену в крошечный ручеек, место шва, который ближе к грудине / грудной кости на свободные узел вокруг вены. Можно использовать крошечные струйки крови, чтобы позже найти дырку в вене, если это станет необходимым.
Дышать и расслабляться (ослабьте мышцы в области шеи и челюсти), чтобы держать глаза на вены через окуляр. Это будет гарантировать, что ваши руки и пальцы будут двигаться безопасно, плавно и спокойно. Удерживая вены пинцетом на стороне, ближайшей кмандибулы, вырезать отверстие в вену между двумя швами с использованием микро-ножницы управляется с другой стороны. Положите микро-ножницы, и держать эту руку расслабленной, почувствовать катетер. Аккуратно получить катетер держа ее между большим и указательным пальцами (рис. 3). Вставьте катетер в отверстие в вену.
Аккуратно продвиньте катетер в правую сердца (рис. 3). Обратите внимание на знаки на катетер, которые дают приблизительный показатель того, насколько катетер должен быть вставлен и наблюдать на мониторе. Как только давление кривые отображаются, осторожно затяните нижний шов вокруг катетера. Поскольку катетер имеет прочность на разрыв, что дает ему катушку, и потому, что дыхание и биение сердца мыши добавить движение, дополнительно прикрепить катетер с помощью липкой ленты.
Запись измерений давления в течение 2 минут для последующего анализа (рис. 4).
Откройте шов проведение катетера, затем аккуратно retrieве катетер. Протрите части за датчиком давления, поместить обратно в стакан с водой. Не прикасайтесь к датчику давления.
Передача мыши на верхнюю часть папиросной бумаги, чтобы площадь для эвтаназии, сбор крови и ткани селезенки. Очистите хирургических инструментов.
Начать процедуру со следующей животных. Когда сроки позволяет, вводить анестетик в ожидании записи кривой давления (2,15).

3. Сбор крови и селезенки Образцы

Inject барбитуратов решение, 400 мкл на мышь и подождать 1-2 мин. Это обычно выполняется в нашей лаборатории, чтобы избежать возможности того, что мышь случайно оправиться от Avertin-анестезии в то же время кровь. Соответствующие стандартизации экспериментом достигается путем введения той же дозы барбитуратов решение на мышь, и, ожидая такого же количества времени до сбора крови. Если это допускается Институциональные уходу и использованию животных комитета итех пор, пока животные тщательно следить за глубиной наркоза до обескровливания, этот шаг может быть опущен.
Сделайте надрез в брюшной полости. Откройте хвостовой вены (полой вены) и собирать крови с использованием передачи пипетки.
Удалить селезенки, или кусок селезенки в трубку Eppendorf и оснастки замораживание в жидком азоте, или в 24-луночный планшет в лунку, содержащую Хэнкс буфер для последующей подготовки отдельных клеток.
Передача мыши на верхнюю часть салфетки для рабочей зоны C для сбора BAL, легких лимфатических узлов, легких, сердца и тканей. Очистите хирургических инструментов.

4. Коллекция легких и сердца Образцы

Проанализируйте трахеи бесплатно мышечной и соединительной ткани. Размещение щипцы под трахеи, тянуть через шов. Аккуратно генерировать достаточный протяжение, чтобы вырезать отверстие. Поддержание нежный стрейч, вставки трахеи канюли использованием слегка поворачивая движения, и шов канюли IntØ место. Для вставки трахеи канюли, убедитесь, что в трахею влажный, при необходимости добавить каплю раствора Хэнкса. На протяжении процедуры, дышать, расслабляться шеи и мышц челюсти, чтобы сохранить движений рук безопасной и гладкой.
Проанализируйте открыть грудную клетку тщательно удаление грудной кости, начиная от брюшной конца. Не беспокоить содержимого грудной клетки, потому что это будет сделать очень трудно найти лимфатических узлов.
Выполните бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), осторожно вставки 1 мл буфера Хэнкс, осторожно поверните шприц и получить БАЛ. Повторите 3 раза, недалеко трубы и место на льду. На протяжении процедуры, держать глаза на конце трахеи канюли, которая подключается к шприцу. Загляните в грудной клетке для наблюдения за инфляцией и дефляцией легких.
Урожай легких лимфатических узлов, держа стены грудной клетки с одним набором щипцов, поиска и извлечения лимфатических узлов с другой пинцет. Место лимфатических узлов в 24-луночный планшет. Важно, чтобы кТеперь где искать: начиная от шеи, найти вход в грудную клетку с правой стороны мыши и смотри выше позвоночника (рис. 5).
Сердце урожая и место на папиросную бумагу. Изолировать правых отделов сердца тщательно рассекает наряду с перегородкой. Переход к рабочей зоны взвесить, записать вес и место в пробирки Эппендорф хватать замораживание в жидком азоте.
Поместить шов вокруг левой доли легкого, чтобы закрыть главный бронх. Проанализируйте доле левого легкого бесплатно, место в Эппендорф трубки и оснастки замораживание в жидком азоте, или место в лунку 24 и пластину, содержащую раствор Хэнкса для последующего выделения одного суспензии клеток.
Вставьте ок. 0,5 мл буферного раствора формальдегида через трахеи канюли в оставшейся долей легких. После инфляции, анализировать легких долях из грудной клетки и поместить в 50 мл пробирку, содержащую раствор формальдегида. Для альтернативной по дизайну исследования, в легких, могут быть накачаны с оптическимал резки средств массовой информации (OCT, разбавленный 1:4 с PBS) и замораживают в форме, содержащей неразбавленном октября для последующей подготовки замороженных срезов. Другое исследование, разработка может потребовать получения оснастки замороженной ткани легких и одного клеточные суспензии из легких. В этом случае, нет инфляции необходимо: вскрыть оставшихся долей легких; извлекать их из грудной клетки и поместить в 24-луночный планшет в лунку, содержащую буфер Хэнкс.
Удалить трахеи канюли, чистый промывать буфером Хэнкс, очистка хирургических инструментов.

5. Анализ кривых давления, полученных в результате Право катетер сердца

Записанное право данными давление желудочка анализируются с помощью LabChart 7 программное обеспечение, не зная групповой идентичности каждой записи. Более 20 кривые выбираются случайным образом, а разница между максимальным и минимальным давлением желудочков для каждой кривой измеряется (DP). Средняя p, рассчитывается дать право Ventricular систолического давления.