Akciğer ve Fareler immün Doku Örneklerinde Hasat ile kombinasyon Sağ Ventrikül Sistolik Basınç Ölçümleri

Özet

Aynı anda sağ kalp fonksiyonu, akciğer iltihabı ve bağışıklık yanıtı araştırmak için bir özel ve hızlı bir protokol bir öğrenme aracı olarak tanımlanmaktadır. Video ve rakamlar büyük ölçekli çalışmalara küçük kullanılmak üzere uyarlanabilir bir organize ekip yaklaşımı, fizyoloji ve mikrodiseksiyon teknikleri anlatıyoruz.

Özet

Sağ kalp fonksiyonu böylece sağ kalp fizyolojisi ve pulmoner vasküler fizyoloji bağlayan, akciğerler aracılığıyla kan pompalamak için. Enflamasyon hücresel infiltrasyon, sitokinler ve büyüme faktörlerinin üretimi, tertipleyerek tarafından ve biçimlenme süreçleri ¹ başlatarak, kalp ve akciğer fonksiyon ortak bir düzenleyicidir.

Sol ventrikül ile karşılaştırıldığında, sağ ventrikül basınç değişikliklerinin nispeten dar bir bölgede faaliyet gösteren bir alçak basınç pompası. Artmış pulmoner arter basıncı akciğer vasküler yatak ve pulmoner hipertansiyon ² içinde basınç artması ile ilişkilidir. Pulmoner hipertansiyon, iltihaplı sık sık akciğer hastalıkları, örneğin kronik obstrüktif akciğer hastalığı, otoimmün hastalıkların ya da ³ ile ilişkilidir. Pulmoner hipertansiyon yaşam ve yaşam beklentisi kalitesi için kötü prognoz bahşeder Çünkü çok araştırma bu mig mekanizmalarının anlaşılması yöneliktirht ilaç müdahalesi ⁴ için hedefler. Pulmoner hipertansiyon için etkin yönetim araçları geliştirilmesi için temel zorluk, moleküler ve hücresel sağ kalp değişiklikler, akciğer ve bağışıklık sisteminin eş zamanlı anlayış karmaşıklığı kalır.

Burada, farelerin sağ kalp basınç değişiklikleri hızlı ve hassas ölçümü için bir usul iş akışı ve kalp, akciğerler ve bağışıklık dokulardan örnekler eşzamanlı hasat sunuyoruz. Yöntemi ilk pulmoner arter ^5-13 baskıların vekil ölçüsü olarak 1990'ların sonunda geliştirilen yakın göğüslü farelerde juguler ven yoluyla sağ ventrikül doğrudan kateterizasyon dayanmaktadır. Organize ekip yaklaşımı çok hızlı bir sağ kalp kateterizasyonu tekniğini kolaylaştırır. Bu da kendiliğinden oda nefes farelerde ölçümlerini yapar. Farklı iş alanlarında iş akışının organizasyonuzaman gecikmesi azaltır ve eşzamanlı fizyolojisi deneyleri ve hasat bağışıklık, kalp ve akciğer dokularında gerçekleştirme imkanı açar.

Burada özetlenen usul akışı büyük ilaç tarama testleri, küçük, hedeflenen deneyler, laboratuvar ortamlarında ve çalışma tasarımları geniş bir yelpazede için adapte edilebilir. Ekokardiyografi ^5,14-17 ve kalp, akciğer ve bağışıklık dokuların hasat kapsayacak şekilde genişletildi olabilir kalp fizyolojisi verilerin eşzamanlı edinimi ileri bilimsel bilgi temeli taşımak veri elde etmek için ihtiyaç duyulan hayvan sayısını azaltır. Burada sunulan usul iş akışı aynı zamanda bağışıklık, akciğer ve kalp fonksiyonu bağlantı ağları bilgi kazanıyor için ideal bir temel sağlar. Burada özetlenen aynı ilkeler gerektiği gibi başka veya ilave organlar çalışmaya adapte edilebilir.

Protokol

1. Hazırlık

1. Aşağıdaki gibi aşağıdaki çözümler ve borular (Tablo 1) hazırlanması:
   1. Hanks çözeltisi, herhangi bir kalsiyum, magnezyum veya gösterge penisilin (100 U / ml) / streptomisin (100 mg / ml).
   2. Fosfat salin (PBS), 1x, hiçbir kalsiyum, magnezyum hiçbir tamponlu.
   3. Etanol,% 70, 500 ml olun.
   4. Formaldehit Buffered, PBS ile% 7-10, 500 ml olun.
   5. Anestezi çözümler:
      1. Avertin. Dikkatle 2,2,2-Tribromoethanol 5 g 2-Metil-2-butanol, 5 ml ekleyin. Bir kere çözülmüş, karanlıkta oda sıcaklığında stok solüsyonu tutun. Stok solüsyon 0.25 ml almak ve cam alt şişe içinde 10 ml 1xPBS ile seyreltin. 37 alüminyum folyo, yer ile şişe sarın ° C çözülmüş ve daha sonra kısım 5 ml polipropilen tüpler içine ve buzdolabında tutun kadar. Deneyin sabahı bir tablet ısıtın.
      2. Barbiturat. % 2.6 barbitürat sol vermek PBS ile stok solüsyon seyreltinution. Polipropilen tüplere 3-4 ml alikotları yerleştirin.
2. Üç işlikler (Şekil 1) düzenleyin.
3. 1. Alan A: Çalışma formuna çalışmada kimlik numarası, tarih, vücut ağırlığı, sağ kalp ağırlıkları, sol kalp ve septum kaydetmek için; vücut ağırlığı belirlemek için hassas terazi (0.01 gr hassasiyet az 0-50 g); mikro ölçeği: aşağıdaki öğeleri düzenleyin 0.001 g hassasiyet de kalp ağırlıkları belirlemek; (cerrahi aletler, tekneler tartın; anestezi çözümleri (açıkça işaretlenmiş); sıvı nitrojen ile küçük Dewar; buz ile yalıtılmış bir kap; tüpleri ve 24-plaka kan ve doku örnekleri (Tablo 1) toplamak Tablo 2, Şekil 2) ve araçlar (Tablo 1) temizlemek için çözümler.
   2. Alan B: diseksiyon mikroskobu, bir amplifikatör ve dizüstü bilgisayara bağlı bir basınç kontrol ünitesine bağlı sağ kalp kateteri: aşağıdaki öğeleri düzenleyin. Kateter içine yerleştirilmiştirsu içeren bir beher. Cerrahi aletler (Tablo 2), optimal uzunluğu sütür kesim parçaları ve bir tekne tartın içine yerleştirilen düzenleyin; bant (otoklav bandı optimal) Optimum uzunluğu ve genişliğine kesilmiş ve kolay erişim için mikroskop veya laboratuar tezgah üzerinde dizilmiş; pamuklu ve saç çıkarıcı çözüm. Çalışmanın başlangıcında kateter kalibre edin.
   3. Alan C:; trakeal kanül; 1 ml şırınga; sütür uygun uzunlukta kesilmiş ve bir tartmak tekne içine yerleştirilir; sıvı nitrojen ile küçük Dewar; buz ile yalıtılmış bir kap; tüpleri ve 24-plaka BAL toplamak için büyüteç objektif: aşağıdaki öğeleri düzenleyin ve doku örnekleri (Tablo 1), cerrahi aletler (Tablo 2); çözümleri BAL gerçekleştirmek ve trakeal kanül ve aletleri (Tablo 1) temizlemek için.

2. Sağ Kalp Kateterizasyonu

1. Yavaşça içine fare koyarak bir hassas terazi kullanarak fare tartılır b tartmakyulaf. Yavaşça ve sessizce hayvan işlemek için emin olun. Ağırlığı kaydedin. Açıklanan protokol, jugular damar çapı basınç kateter yerleştirmek zorunda olduğu için 20 g veya daha fazla olan fareler için en iyi şekilde çalışır, fakat damar yeterince büyük olduğu sürece, daha küçük fareleri (17 g ya da daha fazla) kateterize mümkündür.
2. , Avertin 20 g 200 ul vermek için, örneğin, vücut ağırlığı (tercihen 10 ul / g), isteğe göre enjeksiyon yoluyla fare uyuşturmak için 25 g vermek 250 ul, 30 g 300 ul verir. Tam enjeksiyon hacmi fare suşu bağlı olarak ayarlanması gerekmektedir. Stres anestezik yanıtı değiştirebilir çünkü yavaşça ve sessizce hayvan işlemek için emin olun.
3. Çift pilili kağıt mendil üzerine fare sedatize sonra, yer. Kağıt üzerinde kimlik numarasını not edin. Yavaşça cerrahi alan temizlemek için boynun ventral yönü içine epilasyon losyonu sürün. Kağıda geri fare yerleştirin ve 1-2 dakika bekleyin.
4. Ventral saç kaldırnazikçe pamuklu çubukla tüylerin çıkış yönünün tersine saçını okşayarak tarafından boyun.
5. Dikkatlice ayak refleks yokluğu denetleyerek anestezi yeterli derinliği belirlemek: Fare, ayak kıstırma tepki vermez.
6. Hızlı ve rahat çalışma, sağ kalp kateterizasyonu kalan en iyi, 3-6 dk 10 dakikadan fazla sürmemelidir. Bu kateter damar içine kayma ve nem tabakası üzerinde damar içinde hareket etmesi gerekir, çünkü doku dışarı kuru değil önemlidir. Prosedürün tutarlı bir zamanlama grupları arasında karşılaştırılabilir veri üretimi için önemlidir.
7. Kağıt mendil ve strafor tahta üzerine kağıt mendil ile transferi Yeri fare geri. Otoklav bandı kullanarak yerine pençeleri ve baş Fix.
8. Altçeneleri dan sternum (göğüs-kemiği) için cilt kesi olun.
9. Sağ juguler ven bir açığa altçeneleri doğru tiroid büyük yukarı dikkatlice teşrihnd trakea.
10. Sıra strafor kurulu yaklaşık 0.8x büyütme (toplam büyütme [mercek x göz Adet] yer ve objektif zaten odak düzlemi ile diseksiyon mikroskobu altında fare tutan yaklaşık 8x olduğunu.
11. Dikkatlice cerrahi forseps ile çevreleyen bağ dokusu kaldırarak sağ juguler ven microdissect.
12. Sağ juguler venin üstüne yerleştirin sütür iki adettir. Küçücük bir damla ven kan akışını kapatmak için altçeneleri yakın dikiş Kravat, damar çevresinde gevşek bir düğüm de sternum / göğüs kemiği en yakın sütür koyun. Bir sonraki ven delik bulmak için kan küçük damlama kullanabilirsiniz, gerekli olması halinde.
13. Nefes alın ve mercek aracılığıyla damarın üzerinde gözlerini tutmak için (boyun ve çene kasları gevşetmek) dinlenebilir. Bu ellerinizi ve parmaklarınızı sorunsuz ve rahat, güvenli hareket sağlayacaktır. Yakın tarafında forseps ile ven tutarkenaltçeneleri, diğer taraftan tarafından işletilen mikro-makas kullanarak iki sütür arasındaki damarın içine bir delik kesti. Mikro-makas yere koy, ve el gevşemiş tutarak, kateter için hissediyorum. Hafifçe başparmak ve ilk parmak (Şekil 3) arasında tutarak kateter almak. Ven deliğine kateter yerleştirin.
14. Yavaşça sağ kalp (Şekil 3) içine kateter ilerlemek. Kateter takılması gerekir ne kadar yaklaşık bir dizin vermek ve monitör gözlemlemek kateter de işaretlerini gözlemleyin. Basınç eğrileri gösterilir sonra, yavaşça kateter etrafında alt dikiş sıkıştırın. Kateter bir bobin verir çekme gücüne sahip olduğundan ve fare solunumu ve kalp atışı yapıştırmayın ayrıca, bant kullanarak kateter hareket eklemek için.
15. Daha sonraki analizler için 2 dakika için Tutanak basıncı ölçümleri (Şekil 4).
16. Kateter tutarak dikiş açın, sonra yavaşça Geri alkateter ettik. Basınç dönüştürücü arkasındaki bölümü silin, su ile beher içine geri yerleştirin. Basınç dönüştürücü dokunmayın.
17. Ötenazi alan A, kan ve dalak dokusunun toplama kağıt mendil üstüne fare aktarın. Cerrahi aletler temizleyin.
18. Bir sonraki hayvan ile prosedürü başlatın. Basınç eğrisi (2.15) kaydetmek için beklerken zamanlama izin yaparken, anestezik enjekte edilir.

3. Kan ve Dalak Örnekleri Koleksiyonu

1. Çözümü, fare başına 400 ul barbitürat ve 1-2 dk bekleyin enjekte. Bu rutin havası olurken fare yanlışlıkla avertin-anestezi kurtarmak ihtimalini önlemek için laboratuvarımızda yapılmaktadır. Deney uygun standardizasyon fare başına barbitürat çözelti aynı dozda enjekte, kan ve hasat öncesi zaman aynı miktarda bekleme ile elde edilir. Kurumsal Hayvan Bakım tarafından izin ve Komite kullanın ve varsagibi uzun hayvanlara önce dikkatle kan kaybı ile anestezi derinliği için izlenir olarak, bu adım göz ardı edilebilir.
2. Karın içine kesi olun. Kaudal ven (vena kava) açın ve bir transfer pipet kullanarak kan toplamak.
3. Dalak çıkarın veya Eppendorf tüp ve sıvı azot içinde ek dondurucuya dalak bir parça veya tek hücre sonraki hazırlanması için de içeren Hanks tamponu içine 24 plaka içine.
4. BAL toplanması, akciğer lenf nodu, akciğer ve kalp dokuları için işlik C doku kağıt üstüne fare aktarın. Cerrahi aletler temizleyin.

4. Akciğer ve Kalp Örnekleri Koleksiyonu

1. Kas ve bağ dokusu trakea ücretsiz teşrih. Trakea altında yerleştirilmesi forseps aracılığıyla dikiş çekin. Hafifçe bir delik kesmek için yeterince streç oluşturur. Nazik streç bakımı, biraz döndürerek hareket kullanan trakeal kanül takın ve sütür kanül intyer o. Hanks çözüm bir damla eklemek gerekirse trakeal kanül yerleştirilmesi için, trakea nemli olduğundan emin olun. Prosedürü boyunca, nefes el hareketleri güvenli ve pürüzsüz tutmak için, boyun ve çene kasları gevşer.
2. Dikkatle karın sonundan başlayarak göğüs-kemiği kaldırarak göğüs kafesini açmak teşrih. Bu çok zor lenf düğümü bulmak için yapacak çünkü toraks içeriğini rahatsız etmeyin.
3. Yavaşça Hanks tamponu 1 ml ekleyerek bronkoalveoler lavaj (BAL) gerçekleştirin, yavaşça şırınga açmak ve BAL sıvısı almak. 3 kez, buz üzerinde yakın tüp ve yerde tekrarlayın. Işlem boyunca, şırınga ile bağlanır trakeal kanül ucunda gözler tutun. Akciğerlerin enflasyon ve deflasyon gözlemlemek için toraks Glance.
4. , Forseps bir set ile göğüs kafesi duvarı tutarak bulma ve başka bir forseps ile lenf nodu alarak Hasat akciğer lenf nodu. 24 plaka içine yerleştirin lenf nodu. Bu k önemlidirŞimdi nerede aramak için: boyun başlayarak, (Şekil 5) farenin sağ tarafındaki kaburga kafesinin giriş bulmak ve omurga üzerinde görünüyor.
5. Doku kağıt üzerinde Hasat kalp ve yer. Dikkatle septum yanında diseksiyon ile sağ kalp ayırın. A, tartmak sıvı nitrojen içinde dondurarak snap Eppendorf tüpleri içine ağırlık ve yere kaydetmek için işlik aktarın.
6. Ana bronş kapatmak için sol lobun etrafında dikiş yerleştirin. Eppendorf tüp ve tek hücre süspansiyonları daha sonra izolasyonu için Hanks çözeltisi içeren bir 24 plaka bir kuyunun içine sıvı azot veya bir yerde ek dondurucuya sol lobun ücretsiz yer teşrih.
7. Yaklaşık takın. 0.5 ml kalan akciğer lobu içine trakeal kanül aracılığı ile formaldehid çözeltisinin tamponlu. Enflasyon sonra, formaldehit solüsyon içeren 50 ml'lik tüp içine toraks ve yerin akciğer lobları dışarı teşrih. Alternatif bir çalışma tasarımı için, akciğerlere optimum şişirilir edilebilirmal medya (OCT, PBS 1:4 seyreltilerek) kesme ve frozen sonraki hazırlanması için sulandırılmamış Ekim içeren bir kalıp içinde donmuş. Başka bir çalışmada tasarım çırpıda dondurulmuş akciğer dokusu ve akciğerlerden çıkan tek hücre süspansiyonları elde sebep olabilir. Bu durumda, enflasyon gereklidir: Kalan akciğer lobu teşrih; iyi içeren Hanks tamponu içine 24 plaka içine toraks ve yerden onları almak.
8. Hanks tamponu ile durulayarak temiz trakeal kanül, Kaldır, cerrahi aletler temizleyin.

5. Sağ Kalp Kateter Yaratılan Basıncı Eğrileri Analizi

Kaydedilen sağ ventrikül basınç verileri her kayıt grup kimliğinin hiçbir bilgi ile LabChart 7 yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. 20'den fazla eğrileri rastgele seçilmiş ve her eğri için azami ve asgari ventrikül basıncı arasındaki farkı (ΔP) ölçülür. Ortalama ΔP doğru v vermek için hesaplanırentricular sistolik basınç.

Sonuçlar

Sağ kalp baskı eğrisi elde etmek için birincil sonuç sağ kalp kateteri doğru pozisyon elde edilir. Sağ ventrikül kateter içinin doğru yerleştirme (Şekil 4) basınç yaylaları neden olacağından basınç zaman eğrisinin şekli önemlidir. Spiky eğrileri yerine, sağ ventrikül duvarına solunum veya kalp atım hareketi ile taşınır bir kateter göstermektedir. Hayvanların hayatta kalma evresi ile olası sorunları tespit etmek, ΔP, standart sapma ve kalp hızı hesaplanır gerekmekte...

Tartışmalar

Burada özetlenen deneysel akışı akciğerler, kalp ve farelerde bağışıklık sistemi tepkilerin analizi için sağ ventrikül sistolik basıncı ve numune hasat hızlı ve eş zamanlı olarak ölçülmesini sağlar. Prosedür kalp fizyolojisi ölçümleri, mikro-diseksiyonu ve canlı hücre çalışmaları, histolojik analizler veya dokuların omics-analizi için sonraki doku hasat birleştirir. Tam prosedürü fare başına az 20 dakika sürer. Çünkü işlik organize iş akışının, 2-3 hayvanların aynı and...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isim	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
			Reaktifler
2-Metil-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Dezenfektan sabun (Sarfiyat Sprey TB artı Steris)	Fisher Scientific	1629-1608
Etil Alkol, 200 Proof, Mutlak, Susuz ACS / USP Sınıf	PHARMCO-AAPER	111000200	Distile su ile% 70 sulandırınız
Formaldehit solüsyonu	Sigma-Aldrich	F1635-500ML	7-10% ması sulandırınızPBS stok çözeltisi ve su ile 1 x PBS arasında bir konsantrasyonda ldehyde yoğunlaşma
Hanks çözeltisi, herhangi bir kalsiyum, magnezyum	Fisher Scientific	21-022-CV
Ekim	Tissue-Tek	4583
Penisilin (10.000 U / ml) / streptomisin (10.000 mg / ml) çözelti	Thermo Scientific	SV30010
Fosfat salin (PBS), Kalsiyum, hiçbir magnezyum, 1x ve 10x çözümleri tamponlu	Fisher Scientific
Sodyum pentobarbital% 26	Fort Dodge Hayvan Sağlığı	NDC 0856-0471-01
			Labware
Plakalar 12, 24, 96 kuyu	Şahin
Transferi Pipet	Fisher Scientific	13-711-9BM
Tüp, EDTA kaplamalı	Sarstedt	2013-08
Tüpler 0.65 ml ve 1.7 ml mikro-santrifüj	VWR
Tüpler 12 x 75 mm polipropilen	Fisher Scientific	14-956-1D
Tüpler, çeşitli boyutlarda, polipropilen	Fisher Scientific
			Enstrümanlar
Forseps, Dumon 5. Güzel	Güzel Bilim Araçları	11254-20
Forseps, ekstra ince Graefe-0.5mm ipuçları kavisli	Güzel Bilim Araçları	11152-10
Forseps, ekstra fine Graefe-0.5mm ipuçları düz	Güzel Bilim Araçları	11150-10
Kanül 18ga, 19 ga	BD	Hassas Glide İğneler	Dışında Optimum uzunluk, baskılanmış ve kesin bir kaba dış yüzey oluşturmak için rasped
Makas, Disektör makas ince bıçakları 9cm	Güzel Bilim Araçları	14081-09
BAL, örgülü ipek sütür için Sütür 4-0	Güzel Bilim Araçları	SP116
Sağ kalp kateterizasyonu, örgülü ipek sütür, 6-0 için Sütür	Teleflex tıbbi	18020-60
Şırınga, 1 ml	BD	309659
			Ekipman
Amplifikatör, PowerLab 4/30	ADInstrument	Model ML866
Kateter, basınç F1.4	Millar Instruments, Inc	840-6719
Mikroskop Diseksiyon	Variscope
Forseps, Vannas yay makas-2mm bıçakları	Güzel Bilim Araçları	15000-00
Halojen Danışma Büyütücü Işıklı	Fisher Scientific	11-990-56
Dizüstü bilgisayar	Asus	Model numarası A52F i5 işlemci; 15 inç
Işık kaynağı	Amscope	HL-250-A
Basınç Kontrol Ünitesi	Millar Instruments, Inc	PKB-2000
Yazılım, Labchart-Pro V.7	MSstruments