Ventricular derecha sistólica mediciones de presión en combinación con la cosecha de pulmón y muestras de tejido inmune en ratones

Resumen

Un protocolo específico y rápido para investigar simultáneamente la función del corazón derecho, inflamación pulmonar, y la respuesta inmune que se describe como una herramienta de aprendizaje. Vídeo y figuras describen la fisiología y técnicas de microdisección en un equipo organizado-enfoque que es adaptable para ser utilizado para pequeñas y grandes estudios de tamaño.

Resumen

La función del corazón derecho es bombear sangre a través de los pulmones, uniendo así la fisiología del corazón derecho y la fisiología vascular pulmonar. La inflamación es un modificador común de corazón y la función pulmonar, mediante la elaboración de la infiltración celular, la producción de citoquinas y factores de crecimiento, y mediante el inicio de procesos de remodelación ^1.

En comparación con el ventrículo izquierdo, el ventrículo derecho es una bomba de baja presión que funciona en una zona relativamente estrecha de los cambios de presión. El aumento de la presión arterial pulmonar se asocian con aumento de la presión en el lecho vascular pulmonar y la hipertensión pulmonar ^2. La hipertensión pulmonar se asocia a menudo con enfermedades pulmonares inflamatorias, por ejemplo enfermedad pulmonar obstructiva crónica, o enfermedades autoinmunes ^3. Dado que la hipertensión pulmonar confiere un mal pronóstico para la calidad de vida y la esperanza de vida, mucha investigación se dirige hacia la comprensión de los mecanismos que might ser blanco de ⁴ intervención farmacéutica. El principal desafío para el desarrollo de herramientas de gestión eficaces para la hipertensión pulmonar sigue siendo la complejidad de la comprensión simultánea de los cambios moleculares y celulares en el corazón derecho, los pulmones y el sistema inmunológico.

Aquí, se presenta un flujo de trabajo de procedimiento para la medición rápida y precisa de los cambios de presión en el corazón derecho de ratones y la cosecha simultánea de muestras de corazón, los pulmones y los tejidos inmunes. El método se basa en la cateterización directa del ventrículo derecho a través de la vena yugular en estrecha de pecho ratones, desarrollado por primera vez en la década de 1990 como medida indirecta de la presión en la arteria pulmonar ^5-13. El equipo organizó enfoque facilita una técnica muy rápida cateterismo cardíaco derecho. Esto hace que sea posible llevar a cabo las mediciones en los ratones que espontáneamente respirar aire de la habitación. La organización del flujo de trabajo en distintas áreas de trabajoreduce el tiempo de retardo y abre la posibilidad de realizar simultáneamente experimentos de fisiología y tejidos cosecha corazón inmune, y pulmón.

El flujo de trabajo del procedimiento descrito aquí se puede adaptar para una amplia variedad de entornos de laboratorio y diseños de estudio, a partir de experimentos pequeñas y enfocadas, a grandes ensayos de selección de fármacos. La adquisición simultánea de datos en fisiología cardiaca que se puede ampliar para incluir la ecocardiografía ^5,14-17 y cosecha de los tejidos del corazón, pulmón e inmune reduce el número de animales necesarios para obtener los datos que se mueven a la base de conocimientos científicos adelante. El flujo de trabajo de procedimiento que aquí se presenta también proporciona una base ideal para el conocimiento de las redes que vinculan a pulmón inmune y la función cardiaca. Los mismos principios descritos aquí pueden adaptarse para estudiar otros órganos o adicional según sea necesario.

Protocolo

1. Preparación

1. Preparar las siguientes soluciones y tubos (Tabla 1) como sigue:
   1. Hanks solución, sin calcio, magnesio o indicador con penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 mg / ml).
   2. Salina tamponada con fosfato (PBS), 1x, calcio no, magnesio no.
   3. Etanol, 70%, hacer 500 ml.
   4. Buffered formaldehído, un 7-10% con PBS, hacer 500 ml.
   5. Anestesia soluciones:
      1. Avertin. Añadir cuidadosamente 5 ml de 2-metil-2-butanol a 5 g de 2,2,2-tribromoetanol. Una vez disuelto, mantener solución madre a temperatura ambiente en la oscuridad. Tomar 0,25 ml de la solución madre y se diluye con 10 ml de 1xPBS en botella de vidrio de fondo. Envolver el frasco con hoja de aluminio, lugar a 37 º C hasta que se disolvió y luego alícuota en tubos de 5 ml de polipropileno y mantener en el refrigerador. Calentar una alícuota en la mañana del experimento.
      2. Barbitúricos. Diluir solución madre con PBS para obtener un 2,6% de barbitúricos sollución. Colocar alícuotas de 3-4 ml en tubos de polipropileno.
2. Organizar el trabajo-tres áreas (Figura 1).
3. 1. Zona A: Colocar los siguientes elementos: formulario de estudio para registrar el número de identificación del estudio, la fecha, el peso corporal y peso del corazón derecho, corazón izquierdo y el tabique, balanza de precisión (0-50 g a 0,01 g de precisión) para determinar el peso del cuerpo, escala micro para determinar los pesos del corazón a 0,001 g de precisión; pesan barcos; soluciones de anestesia (claramente marcada); pequeño Dewar con nitrógeno líquido; recipiente aislado con hielo; tubos y la placa de 24-bien para recoger muestras de sangre y tejidos (Tabla 1); instrumentos quirúrgicos ( Tabla 2, Figura 2), y soluciones para limpiar los instrumentos (Tabla 1).
   2. Zona B: Colocar los siguientes elementos: microscopio de disección; catéter pulmonar conectado a una unidad de control de presión que está conectado a un amplificador y un ordenador portátil. El catéter se coloca enun vaso de precipitados que contiene agua. Organizar los instrumentos quirúrgicos (Tabla 2), piezas de corte a la longitud óptima de sutura y se coloca en un barco pesa; cinta (cinta de autoclave es óptimo) corta a la longitud y la anchura óptima y alineados en el banco o en el laboratorio microscopio para facilitar el acceso; hisopos de algodón y pelo removedor de solución. Calibrar el catéter en el inicio del estudio.
   3. Zona C: Coloque los siguientes artículos: lupa lente; cánula traqueal, jeringas de 1 ml, corte a la longitud óptima de sutura y se coloca en un barco pesa; pequeño termo con nitrógeno líquido, recipiente aislado con hielo, tubos y 24-así placa para recoger BAL y muestras de tejido (Tabla 1), y los instrumentos quirúrgicos (Tabla 2), soluciones para realizar BAL y para limpiar la cánula traqueal y los instrumentos (Tabla 1).

2. La cateterización del corazón derecho

1. Pesar ratón utilizando una balanza de precisión colocando suavemente el ratón en un pesaje bavena. Asegúrese de manejar al animal suavemente y en silencio. Registre el peso. El protocolo descrito funciona mejor para los ratones que son 20 g o más, porque el diámetro de la vena yugular tiene que acomodar la sonda de presión, es posible para la cateterización más pequeños ratones (17 g o más), siempre que la vena es lo suficientemente grande.
2. Anestesiar el ratón por inyección con Avertin en función del peso corporal (10 l / g), por ejemplo, para dar 20 g 200 l, para dar 25 g 250 l, para dar 30 g 300 l. El volumen de inyección exacta necesita ser ajustado dependiendo de la cepa de ratón. Asegúrese de manejar el animal suave y silenciosamente porque el estrés puede alterar la respuesta a la anestesia.
3. Una vez que el ratón está sedado, coloque en papel de seda de doble plegado. Tenga en cuenta el número de ID en el papel. Frote suavemente la crema del retiro del pelo en la cara ventral del cuello para limpiar el campo quirúrgico. Coloque el ratón de nuevo en el papel y esperar 1-2 min.
4. Quitar el pelo de la cara ventraldel cuello suavemente acariciando el cabello contra la dirección del crecimiento del pelo con hisopos de algodón.
5. Determinar cuidadosamente la profundidad de anestesia mediante la comprobación de la ausencia del reflejo de dedo del pie: el ratón no reacciona a pellizcos de los dedos del pie.
6. Trabajando rápidamente y relajado, el resto de la cateterización del corazón derecho no debe tomar más de 10 minutos, de manera óptima 3-6 min. Es importante que el tejido no se seque, ya que el catéter debe deslizarse dentro de la vena y se mueven dentro de la vena en una capa de humedad. Tiempo coherente del procedimiento es importante para la generación de los datos que son comparables entre los grupos.
7. Coloque de nuevo el ratón sobre un pañuelo de papel y la transferencia de papel de seda en la espuma de poliestireno bordo. Fijar las patas y la cabeza en su sitio con cinta de autoclave.
8. Hacer la incisión de la piel de las mandíbulas hasta el esternón (esternón).
9. Con cuidado, diseccionar hacia arriba tiroides grandes hacia las mandíbulas para exponer la vena yugular derecha unnd tráquea.
10. Lugar de espuma de poliestireno bordo Manteniendo el ratón bajo el microscopio de disección con el plano de enfoque ya existentes y la lente de aproximadamente 0,8 x ampliación (ampliación total [x lente ocular] es aproximadamente 8 veces.
11. Microdissect cuidadosamente la vena yugular derecha mediante la eliminación de tejido conectivo circundante con pinzas quirúrgicas.
12. Coloque dos piezas de sutura en la parte superior de la vena yugular derecha. Atar la sutura más cercano a las mandíbulas para cerrar el flujo de sangre en la vena para un pequeño goteo, colocar la sutura que está más cerca del esternón / esternón en un nudo flojo alrededor de la vena. Uno puede usar el pequeño goteo de sangre para encontrar más tarde el agujero en la vena, si esto fuera necesario.
13. Respira y relájate (aflojar los músculos del cuello y la mandíbula) para mantener sus ojos en la vena a través del ocular. Esto se asegurará de que sus manos y dedos se moverán de forma segura, suave y relajado. Mientras sostiene la vena con pinzas en el lado más cercano alas mandíbulas, cortar un agujero en la vena entre las dos suturas utilizando micro-tijeras operados por otra parte. Deja las tijeras microempresas, y mantener esa mano relajada, trate de sentir el catéter. Suavemente recuperar el catéter sosteniéndolo entre el pulgar y el dedo índice (Figura 3). Insertar el catéter en el orificio de la vena.
14. Avance suavemente el catéter en el corazón derecho (Figura 3). Observe las marcas en el catéter que da un índice aproximado de hasta qué punto el catéter necesita ser insertado y observar el monitor. Una vez que las curvas de presión se muestran, apretar suavemente la sutura inferior alrededor de la sonda. Debido a que el catéter tiene resistencia a la tracción que le da una bobina, y porque la respiración y los latidos del corazón del ratón añadir movimiento, además, fijar el catéter con cinta adhesiva.
15. Registrar las mediciones de presión durante 2 minutos para su análisis posterior (Figura 4).
16. Abra la sutura de la celebración de la sonda, luego suavemente RetrieVe catéter. Limpiar la parte detrás del transductor de presión, coloque de nuevo en el vaso de precipitados con agua. No toque el transductor de presión.
17. Transferir el ratón en la parte superior del papel de seda a la zona A de la eutanasia, la recogida de tejido de la sangre y el bazo. Limpiar instrumentos quirúrgicos.
18. Iniciar el procedimiento con el siguiente animal. Cuando el tiempo lo permite, inyectar el anestésico mientras espera para registrar la curva de presión (2,15).

3. Toma de muestras de sangre y el bazo

1. Inyectar solución barbitúricos, 400 l por ratón y esperar 1-2 min. Esto se realiza rutinariamente en nuestro laboratorio para evitar la posibilidad de que los ratones sin querer recuperarse de avertina-anestesia mientras desangrado. Normalización adecuada del experimento se consigue mediante la inyección de la misma dosis de solución barbitúrico por ratón, y esperando la misma cantidad de tiempo antes de la cosecha de la sangre. Si está permitido por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión ysiempre y cuando los animales son cuidadosamente monitorizados por la profundidad de la anestesia antes de la exanguinación, este paso puede ser omitido.
2. Hacer incisión en el abdomen. Abrir la vena caudal (vena cava) y recoger la sangre usando una pipeta de transferencia.
3. Extirpar el bazo, o una pieza del bazo en el tubo de Eppendorf y congelamiento rápido en nitrógeno líquido, o en la placa de 24 pocillos en un pozo que contiene tampón de Hanks para la preparación posterior de las células individuales.
4. Transferir el ratón en la parte superior del papel tisú a C del área de trabajo para la recogida de BAL, pulmón drenaje de ganglios linfáticos, el pulmón y los tejidos del corazón. Limpiar instrumentos quirúrgicos.

4. Recolección de muestras de pulmón y corazón

1. Disecciona la tráquea libre de músculo y tejido conectivo. Fórceps inclusión en la traquea, saque la sutura a través. Suavemente generar tramo suficiente para cortar un agujero. Mantener el estiramiento suave, inserte la cánula traqueal con un movimiento ligeramente torneado, y la sutura cánula into lugar. Para la inserción de la cánula traqueal, asegúrese de que la tráquea está húmedo, si es necesario añadir una gota de solución de Hanks. Durante todo el procedimiento, respirar, relajarse cuello y músculos de la mandíbula, para mantener movimientos de la mano segura y sin problemas.
2. Disecciona abrir la caja torácica retirando cuidadosamente el esternón a partir de finales abdominal. No moleste a los contenidos del tórax porque esto hará que sea muy difícil encontrar el ganglio linfático.
3. Realizar el lavado broncoalveolar (BAL), insertando suavemente 1 ml de tampón Hanks, gire suavemente la jeringa y recupere el líquido de BAL. Repetir 3 veces, el tubo de cierre y colocar en hielo. Durante todo el procedimiento, mantener los ojos en el extremo de la cánula traqueal que se conecta a la jeringa. Una mirada a tórax para observar el inflado y desinflado de los pulmones.
4. Pulmón cosecha de ganglios linfáticos mediante la celebración de pared de la caja torácica con un juego de fórceps, encontrar y recuperar el ganglio linfático con otros fórceps. Lugar de ganglios linfáticos en placa de 24 pocillos. Es importante kahora dónde buscar: empezando por el cuello, encontrar la entrada de la caja torácica desde el lado derecho del ratón y mirar por encima de la espina dorsal (Figura 5).
5. Harvest corazón y colocar en papel de seda. Aislar el lado derecho del corazón mediante una cuidadosa disección lado del tabique. Traslado al trabajo de la zona A de pesar, registrar el peso y el lugar en tubos eppendorf para ajustar congelación en nitrógeno líquido.
6. Coloque sutura alrededor del lóbulo pulmonar izquierdo para cerrar el bronquio principal. Diseccionar el pulmón izquierdo lóbulo libre, lugar en el tubo eppendorf y congelamiento rápido en nitrógeno líquido, o el lugar en un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenía solución de Hanks para el aislamiento posterior de suspensiones de células individuales.
7. Inserte aprox. 0,5 ml solución tamponada de formaldehído a través de la cánula traqueal en los lóbulos pulmonares restantes. Después de la inflación, diseccionar los lóbulos pulmonares fuera del tórax y el lugar en el tubo de 50 ml que contiene una solución de formaldehído. Para un estudio de diseño alternativo, los pulmones se pueden inflar con optimal corte de los medios de comunicación (octubre, se diluyó 1:4 con PBS) y se congeló en un molde que contiene octubre sin diluir para la preparación posterior de secciones congeladas. Otro diseño del estudio podría requerir la obtención de tejido pulmonar congelado complemento y suspensiones de células individuales de los pulmones. En ese caso, no es necesario inflación: diseccionar los lóbulos pulmonares restantes; recuperarlos del tórax y el lugar en la placa de 24 pocillos en un pozo que contiene tampón de Hanks.
8. Retire la cánula traqueal, limpio por lavado con tampón de Hanks, limpiar los instrumentos quirúrgicos.

5. El análisis de las curvas de presión generadas a partir del catéter pulmonar

Los datos registrados de presión ventricular derecha se analizan utilizando LabChart 7 software sin conocimiento de la identidad de grupo de cada grabación. Más de 20 curvas se seleccionan al azar y la diferencia entre la máxima y la presión ventricular mínima para cada curva de medición (DP). La? P media se calcula a dar el derecho vpresión sistólica entricular.

Resultados

El resultado primario para la obtención de curvas de presión derecho del corazón se logra por la posición correcta del catéter en el corazón derecho. La forma de las curvas de presión de tiempo es crítico porque la correcta colocación del catéter dentro del ventrículo derecho se traducirá en mesetas de presión (Figura 4). Curvas de punta, en cambio, indican un catéter que se mueve por la respiración o el movimiento latido del corazón contra la pared del ventrículo derecho. Para detectar...

Discusión

El flujo experimental descrito aquí permite la medición rápida y simultánea de la presión sistólica del ventrículo derecho y la cosecha de las muestras para el análisis de las respuestas en los pulmones, el corazón y el sistema inmune en ratones. El procedimiento combina mediciones cardíacas fisiología, micro-disección y posterior cosecha de tejidos para estudios de células vivas, el análisis histológico o ómicas-análisis de los tejidos. El procedimiento completo tarda menos de 20 min por ratón. Debido...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
			Reactivos
2-metil-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463
2,2,2-tribromoetanol	Sigma-Aldrich	T48402
desinfectante jabón (Cobertura de rociado más Steris TB)	Fisher Scientific	1629-08
Alcohol etílico, 200 Proof, Absolute, anhidro ACS / USP Grade	Pharmco-AAPER	111000200	Diluir a 70% con agua destilada
Solución de formaldehído	Sigma-Aldrich	F1635-500ML	Diluir hasta un 7-10% de formaldehyde concentración a una concentración de 1x PBS utilizando PBS solución madre y agua
Hanks solución, sin calcio, magnesio	Fisher Scientific	21-022 CV-
Octubre	Tissue-Tek	4583
Penicilina (10.000 U / ml) / estreptomicina (10.000 mg / ml) solución	Thermo Scientific	SV30010
Salina tamponada con fosfato (PBS), sin calcio, magnesio no, las soluciones de 1x y 10x	Fisher Scientific
Pentobarbital sódico 26%	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-0471-01
			Labware
Las placas 12, 24, 96 así	Halcón
Transferencia Pipet	Fisher Scientific	13-711 9BM-
Tube, EDTA revestida	Sarstedt	2013-08
Tubos de 0,65 ml y 1,7 ml de centrífuga micro-	VWR
Tubos de 12 x 75 mm de polipropileno	Fisher Scientific	14-956-1D
Tubos, varios tamaños, polipropileno	Fisher Scientific
			Instrumentos
Pinzas, Dumon º 5 Fine	Herramientas Artes Ciencias	11254-20
Pinzas, extra fino Graefe-0.5mm puntas curvas	Herramientas Artes Ciencias	11152-10
Pinzas, extra fine Graefe-0.5mm tips recta	Herramientas Artes Ciencias	11150-10
La cánula calibre 18, 19 ga	BD	Precisión Glide Needles	Cortar a la longitud óptima, se hizo romo y fuera de raspado para crear una superficie exterior rugosa
Tijeras, tijeras de disección-delgadas hojas de 9cm	Herramientas Artes Ciencias	14081-09
Sutura de BAL, sutura de seda trenzada, 4-0	Herramientas Artes Ciencias	SP116
Sutura de cateterismo cardíaco derecho, sutura trenzada de seda, 6-0	Teleflex Medical	18020-60
Jeringa, 1 ml	BD	309659
			Equipo
Amplificador, PowerLab 4/30	ADInstrument	Modelo ML866
Catéter, presión F1.4	Millar Instruments, Inc	840-6719
Microscopio de disección	Variscope
Pinzas, tijeras Vannas primavera-2mm cuchillas	Herramientas Artes Ciencias	15000-00
Lupa luminosa halógena Desk	Fisher Scientific	11-990-56
Ordenador portátil	Asus	Número de modelo del procesador i5 A52F, 15 pulgadas
Fuente de luz	Amscope	HL-250-A
Unidad de Control de Presión	Millar Instruments, Inc	PCU-2000
Software, LabChart-Pro V.7	En ADinstrumentos