Ventricolo destro di pressione sistolica Misure in combinazione con raccolta di campioni di tessuto polmonare e immunitaria nei topi

Riepilogo

Un protocollo specifico e rapido per indagare contemporaneamente la funzione del cuore destro, infiammazione polmonare, e la risposta immunitaria viene descritto come strumento di apprendimento. Video e dati descrivono fisiologia e tecniche di microdissezione organizzata in un approccio di squadra che è adattabile per essere utilizzato per piccole e grandi dimensioni studi.

Abstract

La funzione del cuore destro è di pompare sangue attraverso i polmoni, collegando così fisiologia del cuore destro e fisiologia vascolare polmonare. L'infiammazione è un modificatore comune di cuore e funzione polmonare, elaborando infiltrazione cellulare, la produzione di citochine e fattori di crescita, e avviando processi di rimodellamento ^1.

Rispetto al ventricolo sinistro, il ventricolo destro è una pompa a bassa pressione che opera in una zona relativamente ristretta di variazioni di pressione. Aumentato la pressione arteriosa polmonare sono associati con un aumento della pressione nel letto vascolare polmonare e ipertensione polmonare ^2. L'ipertensione polmonare è spesso associata a malattie polmonari infiammatorie, ad esempio cronica ostruttiva, o malattie autoimmuni ^3. Poiché l'ipertensione polmonare conferisce una prognosi negativa per la qualità della vita e la speranza di vita, gran parte della ricerca è orientata verso la comprensione dei meccanismi che might essere gli obiettivi per ⁴ intervento farmaceutico. La sfida principale per lo sviluppo di strumenti di gestione efficaci per l'ipertensione polmonare rimane la complessità della comprensione simultanea di cambiamenti molecolari e cellulari nel cuore destro, i polmoni e il sistema immunitario.

Qui, presentiamo un workflow procedurale per la misurazione rapida e precisa delle variazioni di pressione nel cuore destro di topi e la raccolta simultanea di campioni dal cuore, polmoni e tessuti immunitarie. Il metodo si basa sulla cateterizzazione diretta del ventricolo destro attraverso la vena giugulare in stretta a torso topi, sviluppato alla fine del 1990 come parametro di misurazione della pressione in arteria polmonare ^5-13. La squadra ha organizzato approccio facilita una tecnica molto rapida diritto cateterismo cardiaco. Ciò rende possibile effettuare le misure in topi che spontaneamente respirano aria ambiente. L'organizzazione del flusso di lavoro in distinte aree di lavoro-riduce il tempo di ritardo e si apre la possibilità di eseguire contemporaneamente esperimenti di fisiologia e di raccolta dei tessuti immunitario, cardiache e polmonari.

Il flusso di lavoro procedurale qui descritto può essere adattato per una vasta gamma di ambienti di laboratorio e disegni di studio, da piccoli, esperienze mirate, di grandi saggi di screening di stupefacenti. L'acquisizione contemporanea dei dati di fisiologia cardiaca che può essere ampliato per includere l'ecocardiografia ^5,14-17 e la raccolta dei tessuti del cuore, del polmone e del sistema immunitario riduce il numero di animali necessari per ottenere i dati che si muovono la base delle conoscenze scientifiche in avanti. Il flusso di lavoro procedurale qui presentato fornisce anche una base ideale per la conoscenza delle reti che collegano immunitario, polmoni e la funzione del cuore. Gli stessi principi descritti qui possono essere adattati per studiare altri organi o aggiuntiva come richiesto.

Protocollo

1. Preparazione

1. Preparare le seguenti soluzioni e tubi (Tabella 1) come segue:
   1. Hanks soluzione, no, magnesio calcio o indicatore con penicillina (100 U / ml) / streptomicina (100 mg / ml).
   2. Tampone fosfato salino (PBS), 1x, no calcio, magnesio no.
   3. Etanolo, 70%, 500 ml fare.
   4. Tamponata di formaldeide, il 7-10% con PBS, fare 500 ml.
   5. Anestesia soluzioni:
      1. Avertin. Cautela aggiungere 5 ml di 2-metil-2-butanolo a 5 g di 2,2,2-Tribromoethanol. Una volta sciolto, tenere soluzione madre a temperatura ambiente al buio. Prendete 0,25 ml di soluzione madre e diluire con 10 ml di 1xPBS in bottiglia di vetro inferiore. Avvolgere la bottiglia con foglio di alluminio, posto a 37 ° C fino a completa dissoluzione e poi aliquotare in tubi di polipropilene da 5 ml e conservare in frigorifero. Scaldare uno aliquota la mattina dell'esperimento.
      2. Barbiturici. Diluire soluzione madre con PBS per ottenere 2,6% barbiturici solution. Posizionare aliquote 3-4 ml in tubi di polipropilene.
2. Organizzare il lavoro tre-aree (Figura 1).
3. 1. Area A: Disporre i seguenti elementi: la forma di studio per registrare il numero di identificazione di studio, la data, il peso corporeo, i pesi del cuore destro, cuore sinistro e del setto, bilancia di precisione (0-50 g a 0,01 g di precisione) per determinare il peso corporeo; scala micro per determinare i pesi del cuore a 0,001 g di precisione, pesa imbarcazioni; soluzioni anestesia (chiaramente); dewar piccola con azoto liquido, contenitore isolato sotto ghiaccio, tubi e piastra a 24 pozzetti per la raccolta di sangue e campioni di tessuto (Tabella 1), strumenti chirurgici ( Tabella 2, Figura 2), e soluzioni per pulire gli strumenti (Tabella 1).
   2. Area B: Disporre i seguenti elementi: microscopio da dissezione; catetere cuore destro collegato a un'unità di controllo della pressione che è collegato ad un amplificatore e computer portatile. Il catetere viene inserito inun becker contenente acqua. Disporre di strumenti chirurgici (Tabella 2), pezzi di taglio di sutura per lunghezza ottimale e inseriti in una pesa barca; nastro (nastro autoclave è ottimale), tagliati in lunghezza ottimale e larghezza e allineati sul banco microscopio o di laboratorio per un facile accesso, tamponi di cotone e Depilatore soluzione. Calibrare il catetere all'inizio dello studio.
   3. Area C: Disporre le seguenti voci: lente d'ingrandimento lente, cannula tracheale, siringhe da 1 ml, con taglio di sutura per lunghezza ottimale e inserito in un peso barca, piccolo dewar con azoto liquido, contenitore isolato sotto ghiaccio, tubi e 24 pozzetti per la raccolta BAL e campioni di tessuto (Tabella 1), strumenti chirurgici (Tabella 2), soluzioni per eseguire BAL e per la pulizia della cannula tracheale e gli strumenti (Tabella 1).

2. Cateterismo cardiaco destro

1. Pesare mouse utilizzando una bilancia di precisione con un leggero posizionando il mouse in una pesata bavena. Assicurati di gestire l'animale delicato e silenzioso. Registrare il peso. Il protocollo descritto funziona meglio per topi che sono 20 go più perché il diametro della vena giugulare deve accogliere il catetere di pressione, è possibile cateterizzare piccoli topi (17 g o più) purché la vena è abbastanza grande.
2. Anestetizzare il mouse per iniezione con Avertin a seconda del peso corporeo (10 microlitri / g), ad esempio per dare 20 g 200 pl, per dare 25 g 250 microlitri, per dare 30 g 300 ul. Il volume di iniezione esatta deve essere regolato a seconda del ceppo di topo. Assicurati di gestire l'animale delicato e silenzioso perché lo stress può alterare la risposta al anestetico.
3. Una volta che il mouse è sedato, posto su due pieghe carta velina. Prendere nota del numero ID sulla carta. Strofinare delicatamente la rimozione lozione per capelli nella parte ventrale del collo per cancellare il campo operatorio. Posizionare il mouse avanti sulla carta e attendere per 1-2 min.
4. Eliminare i peli sotto l'aspetto ventraledel collo accarezzando delicatamente i capelli contro la direzione della crescita dei capelli con tamponi di cotone.
5. Attentamente determinare la profondità sufficiente di anestesia controllando l'assenza del riflesso punta: il mouse non reagisce pizzicamento delle sue dita.
6. Di lavoro in modo rapido e rilassato, il resto del cateterismo cardiaco destro non dovrebbe richiedere più di 10 minuti, in modo ottimale 3-6 min. È importante che il tessuto non si asciuga, perché il catetere deve scivolare nella vena e muoversi all'interno della vena su un livello di umidità. Temporizzazione consistente della procedura è importante per la generazione di dati comparabili fra i gruppi.
7. Mouse avanti Posto su carta velina e il trasferimento con la carta velina sul polistirolo bordo. Fissare le zampe e la testa in posizione con del nastro autoclave.
8. Fare un'incisione della pelle da mandibole allo sterno (sterno).
9. Sezionare con cura verso l'alto della tiroide grandi verso le mandibole per esporre la vena giugulare destra unnd trachea.
10. Luogo polistirolo bordo tenendo premuto il mouse sotto il microscopio dissezione con il piano di messa a fuoco già in atto e l'obiettivo a circa 0,8 x ingrandimento (ingrandimento totale [x lente oculare] è di circa 8x.
11. Attenzione microdissect la vena giugulare destra rimuovendo circostante tessuto connettivo con una pinza chirurgica.
12. Posto due pezzi di sutura sopra la vena giugulare destra. Legare la sutura più vicina alle mandibole per chiudere il flusso di sangue nella vena di un filo piccolo, posizionare la sutura che è più vicino allo sterno / sterno in un nodo allentato attorno alla vena. Si può utilizzare il filo 'di sangue per trovare poi il foro nella vena, ciò dovesse rendersi necessario.
13. Respirare e rilassarsi (sciogliere i muscoli del collo e della mascella) di tenere gli occhi sulla vena attraverso l'oculare. Questo farà sì che le mani e le dita si muovono in modo sicuro, senza intoppi e rilassata. Tenendo la vena con pinza sul lato più vicinole mandibole, un foro nella vena tra le due suture utilizzando micro-forbici operati da dall'altro. Metti giù le micro-forbici, e mantenendo quel rilassato mano, sentire per il catetere. Recuperare il catetere delicatamente tenendolo tra il pollice e l'indice (Figura 3). Inserire il catetere nel foro della vena.
14. Delicatamente avanzare il catetere nel cuore destro (Figura 3). Osservare i segni al catetere che danno un indice approssimativo di quanto il catetere deve essere inserito e osservare il monitor. Una volta che le curve di pressione vengono visualizzati, serrare leggermente la sutura inferiore intorno al catetere. Poiché il catetere presenta resistenza alla trazione che dà una bobina, e perché il battito cardiaco e la respirazione del mouse aggiungere movimento, inoltre apporre il catetere con nastro.
15. Misurazioni della pressione record per 2 minuti per una successiva analisi (Figura 4).
16. Aprire la sutura tenendo il catetere, poi delicatamente Retrieve catetere. Pulire la parte dietro il trasduttore di pressione, posizionare nuovamente dentro il bicchiere con acqua. Non toccare il trasduttore di pressione.
17. Trasferire il mouse sopra la carta velina per area A per l'eutanasia, la raccolta di sangue e di tessuto milza. Pulire gli strumenti chirurgici.
18. Avviare la procedura con l'animale successivo. Quando la temporizzazione permette, iniettare l'anestetico in attesa di registrare la curva di pressione (2,15).

3. Raccolta di campioni di sangue e Milza

1. Iniettare la soluzione barbiturici, 400 microlitri per topo e attendere 1-2 min. Questa viene eseguita di routine nel nostro laboratorio per evitare la possibilità che i topi inavvertitamente recuperare da Avertin-anestesia, mentre dissanguamento. Normalizzazione appropriata dell'esperimento è ottenuta iniettando la stessa dose di soluzione barbiturico per topo, e attendendo la stessa quantità di tempo prima della raccolta del sangue. Se consentito dal Animal Care istituzionale e uso Comitato epurché gli animali sono attentamente monitorati per la profondità di anestesia prima dissanguamento, questo passaggio può essere omesso.
2. Fai incisione nell'addome. Aprire la vena caudale (vena cava) e raccogliere il sangue con una pipetta di trasferimento.
3. Rimuovere la milza, o un pezzo di milza nel tubo Eppendorf e congelare a scatto in azoto liquido, o nella piastra a 24 pozzetti in un tampone contenente ben Hanks per la preparazione successiva delle singole cellule.
4. Trasferire il mouse sopra la carta velina per area di lavoro C per la raccolta di BAL, linfonodo drenante polmone, polmone, e tessuti cardiaci. Pulire gli strumenti chirurgici.

4. Raccolta di polmone e Campioni Cuore

1. Staccare il libero trachea del muscolo e del tessuto connettivo. Pinza messa sotto la trachea, tirare sutura attraverso. Delicatamente generare tratto sufficiente per tagliare un buco. Mantenere il tratto gentile, inserire la cannula tracheale con un movimento un po 'di svolta, e sutura cannula into posto. Per l'inserimento della cannula tracheale, assicurarsi che la trachea è umido, eventualmente aggiungere una goccia di soluzione di Hanks. Nel corso della procedura, respirare, rilassare collo e muscoli della mascella, per mantenere i movimenti della mano sicura e agevole.
2. Dissect aprire la gabbia toracica con attenzione rimuovendo lo sterno a partire dalla fine addominale. Non disturbare il contenuto del torace, perché questo rende molto difficile trovare il linfonodo.
3. Eseguire lavaggio broncoalveolare (BAL) delicatamente inserendo 1 ml di tampone Hanks, ruotare leggermente la siringa e recuperare BAL. Ripetere 3 volte, tubo stretto e posto sul ghiaccio. Durante tutta la procedura, tenere gli occhi sulla estremità della cannula tracheale che collega alla siringa. Uno sguardo al torace per osservare l'inflazione e la deflazione dei polmoni.
4. Harvest linfonodi polmonari tenendo gabbia toracica parete con un set di pinze, trovare e recuperare il linfonodo con un altro pinza. Luogo linfonodo in 24 pozzetti. È importante kora dove cercare: partendo dal collo, trovare l'entrata della gabbia toracica dal lato destro del mouse e guardare sopra la colonna vertebrale (Figura 5).
5. Harvest cuore e il luogo su carta velina. Isolare il cuore destro con attenzione dissezione lungo il setto. Trasferimento a lavoro-area A pesare, registrare il peso e il luogo in provette eppendorf a scatto congelamento in azoto liquido.
6. Posizionare sutura intorno al lobo polmonare sinistro per chiudere il bronco principale. Staccare il polmone sinistro lobo libero, posto nel tubo eppendorf e congelare in azoto liquido a scatto, o il luogo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenenti soluzione di Hanks per l'isolamento successivo di sospensioni di cellule singole.
7. Inserisci ca. 0,5 ml di soluzione tamponata di formaldeide attraverso la cannula tracheale nei lobi polmonari rimanenti. Dopo l'inflazione, sezionare i lobi polmonari fuori del torace e del luogo in tubo da 50 ml contenente una soluzione di formaldeide. Per un progetto di studio alternativo, i polmoni possono essere gonfiati con ottiMal di taglio dei media (OCT, diluito 1:4 con PBS) e congelato in uno stampo contenente ottobre non diluiti per la preparazione successiva di sezioni congelate. Un altro disegno dello studio potrebbe richiedere di ottenere tessuto polmonare congelato a scatto e sospensioni di cellule singole dai polmoni. In tal caso, non è necessario inflazione: sezionare i lobi polmonari rimanenti; recuperarli dal torace e posto nella piastra a 24 pozzetti in un tampone contenente ben Hanks.
8. Rimuovere cannula tracheale, pulita risciacquo con tampone Hanks, pulire strumenti chirurgici.

5. L'analisi delle curve di pressione generate dallo catetere cardiaco destro

I dati relativi alla pressione registrati destro ventricolare vengono analizzati utilizzando LabChart 7 software senza conoscere l'identità di gruppo di ogni registrazione. Più di 20 curve sono selezionati in modo casuale e la differenza tra la massima e la pressione ventricolare minima per ogni curva misurata (AP). Il AP medio è calcolato per ottenere il diritto vpressione sistolica entricular.

Risultati

Il risultato primario per ottenere giuste curve di pressione cardiaca si ottiene il corretto posizionamento del catetere cuore destro. La forma delle curve tempo la pressione è fondamentale perché il corretto posizionamento del catetere all'interno del ventricolo destro comporterà altipiani pressione (Figura 4). Spine ricurve, invece, indicano un catetere che viene spostato dal respiro o battito cardiaco movimento contro la parete del ventricolo destro. Per rilevare potenziali problemi con la fas...

Discussione

Il flusso sperimentale qui descritto consente la misurazione rapida e simultanea della pressione sistolica ventricolare destra e la raccolta di campioni per l'analisi delle risposte nel cuore, i polmoni e il sistema immunitario in topi. La procedura combina misure di fisiologia cardiaca, micro-dissezione e la raccolta dei tessuti successivo per studi sulle cellule vive, analisi istologiche, o omiche-analisi dei tessuti. La procedura completa richiede meno di 20 minuti per topo. A causa della zona lavoro organizzato ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
			Reagenti
2-metil-2-butanolo	Sigma-Aldrich	152463
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
disinfettante sapone (copertura Spray TB più Steris)	Fisher Scientific	1629-1608
Alcool etilico, 200 Proof, Absolute, anidro ACS / USP Grade	PHARMCO-AAPER	111000200	Diluire al 70% con acqua distillata
Formaldeide soluzione	Sigma-Aldrich	F1635-500ML	Diluire a un 7-10% formaconcentrazione ldehyde ad una concentrazione di PBS 1x utilizzando PBS soluzione madre e acqua
Hanks soluzione, no, calcio e magnesio	Fisher Scientific	21-022-CV
Ottobre	Tissue-Tek	4583
Penicillina (10.000 U / ml) / streptomicina (10.000 mg / ml) soluzione	Thermo Scientific	SV30010
Tampone fosfato salino (PBS), nessun calcio, magnesio no, soluzioni 1x e 10x	Fisher Scientific
Pentobarbital di sodio 26%	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-0471-01
			Labware
Piatti 12, 24, 96 e	Falco
Trasferimento Pipettare	Fisher Scientific	13-711-9BM
Tube, EDTA rivestito	Sarstedt	2013-08
Provette 0,65 ml e 1,7 ml micro-centrifuga	VWR
Tubi 12 x 75 mm polipropilene	Fisher Scientific	14-956-1D
Tubi, di varie dimensioni, in polipropilene	Fisher Scientific
			Strumenti
Pinza, Dumon # 5 Belle	Strumenti Scienza Belle	11254-20
Pinze, extra fini Graefe-0.5mm punte curve	Strumenti Scienza Belle	11152-10
Pinze, extra fine Graefe-0.5mm punte diritte	Strumenti Scienza Belle	11150-10
Cannula 18GA, 19 ga	BD	Precision Glide Aghi	Tagliare alla lunghezza ottimale, smussati e fuori gracchiò per creare una superficie ruvida esterna
Forbici, forbici dissettore-sottili lame 9 centimetri	Strumenti Scienza Belle	14081-09
Sutura per BAL, sutura di seta intrecciata, 4-0	Strumenti Scienza Belle	SP116
Sutura per cateterismo cardiaco destro, sutura di seta intrecciata, 6-0	Teleflex Medical	18020-60
Siringa, 1 ml	BD	309659
			Attrezzatura
Amplificatore, PowerLab 4/30	ADInstrument	Modello ML866
Catetere, pressione F1.4	Millar Instruments, Inc	840-6719
Dissezione Microscopio	Variscope
Pinze, forbici Vännäs primavera-2mm lame	Strumenti Scienza Belle	15000-00
Lente luminosa alogena Desk	Fisher Scientific	11-990-56
Computer portatile	Asus	Numero di modello A52F i5 processore; 15 pollici
Fonte di luce	Amscope	HL-250-A
Unità di controllo della pressione	Millar Instruments, Inc	PCU-2000
Software, Labchart-Pro V.7	DC Instruments