מדידות נכונות חדרית סיסטולי לחץ בשילוב עם קציר של ריאה ודגימות רקמה חיסוניות בעכברים

Wen-Chi Chen; Sung-Hyun Park; Carol Hoffman; Cecil Philip; Linda Robinson; James West; Gabriele Grunig

doi:10.3791/50023

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

פרוטוקול ספציפי ומהיר במקביל לחקירת פונקציה נכונה לב, דלקת ריאות, והתגובה החיסונית מתואר ככלי למידה. וידאו ודמויות מתארים פיזיולוגיה וטכניקות microdissection בצוות גישה מאורגנת שניתנת להתאמה לשימוש לקטן למחקרים בגודל גדולים.

Abstract

תפקוד הלב הנכון הוא להזרים דם דרך הריאות, ובכך מקשר פיזיולוגית לב ימנית ופיזיולוגיה של כלי דם ריאתי. דלקת היא צירוף שכיח של תפקוד לב וריאות, על ידי חדירה לפרט סלולרית, ייצור ציטוקינים וגורמי גדילה, ועל ידי ייזום תהליכי שיפוץ ^1.

בהשוואה לחדר השמאלי, חדר ימין הוא משאבה בלחץ נמוך הפועלת באזור צר יחסי של שינויים בלחץ. לחצי עורק ריאה מוגברת קשורים ללחץ מוגבר במיטת כלי דם הריאה ויתר לחץ דם ריאתי ^2. יתר לחץ דם ריאה קשור לעתים קרובות עם מחלות דלקתיות ריאה, למשל מחלת ריאות חסימתית כרונית, או מחלות אוטואימוניות ^3. בגלל יתר לחץ דם ריאה מעניק פרוגנוזה גרועה לאיכות חיים ותוחלת חיים, הרבה מחקר מכוון להבנת המנגנונים שהמיגHT להיות מטרות להתערבות ⁴ תרופות. האתגר העיקרי לפיתוח של כלים לניהול יעילים עבור יתר לחץ דם ריאתי נשאר את המורכבות של ההבנה סימולטנית של שינויים מולקולריים ותאיים בלב הימני, ריאות ולמערכת החיסונית.

כאן, אנו מציגים את זרימת פרוצדורליים למדידה המהירה ומדויקת של שינויים בלחץ בלב הימני של עכברים וקציר סימולטני של דגימות מלב, ריאות ורקמות חיסוניות. השיטה מבוססת על הצנתור הישיר של חדר ממני דרך וריד הצוואר בעכברים קרובים חזה, פותח לראשונה בסוף 1990 כמדד חלופי של לחצים בעורק הריאה ^5-13. צוות הגישה המאורגנת מאפשרת טכניקת צנתור מהירה מאוד נכונה לב. זה מאפשר לבצע את המדידות בעכברים כי באופן ספונטני לנשום אוויר חדר. הארגון של זרימת העבודה באזורי עבודה שונים-מפחית את השהיית זמן ופותח את האפשרות במקביל לביצוע ניסויי פיזיולוגיה וקציר רקמות חיסוניים, לב וריאות.

זרימת פרוצדורליים המתוארים כאן ניתן להתאים למגוון רחב של הגדרות במעבדה ועיצובי לימוד, מניסויים קטנים וממוקדים, למבחני מיון תרופות גדולים. הרכישה סימולטני של נתוני פיזיולוגית לב כי ניתן להרחיב לכלול אקו ^5,14-17 וקציר של רקמות לב, ריאה וחיסון מפחיתה את מספר בעלי החיים הדרושים כדי להשיג נתונים שנעים בבסיס הידע המדעי קדימה. זרימת פרוצדורליים מוצגת כאן גם מספקת בסיס אידיאלי לרכישת ידע מהרשתות שהקישור, ריאות חיסוניות ותפקוד לב. את אותם עקרונות שהתוו כאן ניתן להתאים ללמוד איברים אחרים או נוספים במידת צורך.

Protocol

1. הכנה

הכן את הפתרונים הבאים ואבובים (לוח 1), כדלקמן:
1. הנקס פתרון, לא סידן, מגנזיום או חיווי עם פניצילין (100 U / ml) / סטרפטומיצין (100 מ"ג / מ"ל).
2. נאגר מלוח פוספט (PBS), 1x, לא סידן, לא מגנזיום.
3. אתנול, 70%, להפוך את 500 מ"ל.
4. Buffered פורמלדהיד, 7-10% עם PBS, להפוך את 500 מ"ל.
5. פתרוני אלחוש:
  1. Avertin. בזהירות להוסיף 5 מ"ל של 2-Methyl-2-butanol עד 5 גרם של 2,2,2-Tribromoethanol. נמס ברגע, לשמור פתרון מנייה בטמפרטורת חדר בחושך. קח 0.25 מ"ל של פתרון המנייה ולדלל אותו עם 10 מ"ל של 1xPBS בבקבוק זכוכית תחתונה. לעטוף את הבקבוק בנייר אלומיניום, במקום על 37 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה ולאחר מכן aliquot לתוך 5 צינורות פוליפרופילן מ"ל ולשמור במקרר. לחמם aliquot 1 בבוקרו של הניסוי.
  2. חומר הרגעה. לדלל פתרון מניות עם PBS לתת 2.6% רביטורטים סולution. הנח aliquots מ"ל 3-4 בצינורות פוליפרופילן.
ארגן 3 עבודת אזורים (איור 1).
1. אזור: סדר את הפריטים הבאים: טופס מחקר להקליט מספר זיהוי מחקר, תאריך, משקל גוף, משקולות של לב ימני, לב ומחץ שמאל; קנה מידת דיוק (0-50 בגרם דיוק 0.01 גר ') כדי לקבוע את משקל גוף; קנה מידת מייקרו כדי לקבוע משקולות לב בדיוק 0.001 גרם; פתרוני הרדמה (מסומן באופן ברור);; לשקול סירות קטנים דיואר עם חנקן נוזלי; מכל מבודד עם קרח; צינורות וצלחת 24 גם לאיסוף דם ודגימות רקמה (טבלה 1); מכשירי ניתוח ( טבלה 2, איור 2); ופתרונות כדי לנקות את המכשירים (טבלה 1).
2. השטח B: סדר את הפריטים הבאים: מיקרוסקופ לנתח; קטטר לב הימני מחובר ליחידת שליטה בלחץ שמחוברת למגבר ומחשב נייד. מכניס צנתרמבחנה המכילה מים. סדר מכשירי ניתוח (טבלה 2), חתיכות לחתוך תפר לאורך אופטימלי והניח למשקל סירה; קלטת (קלטת חיטוי היא אופטימלית) חתוכה להאורך ולרוחב האופטימלי ועומדת בשורה על ספסל מיקרוסקופ או במעבדה לשם גישה נוחה; מטליות גפן פתרון מסיר שיער. כייל את הצנתר בתחילת המחקר.
3. השטח C: סדר את הפריטים הבאים: זכוכית מגדלת העדשה; צינורית קנה נשימה; 1 מיליליטר מזרקים; לחתוך תפר לאורך אופטימלי ולהציב לתוך סירה לשקול; דיואר הקטן עם חנקן נוזלי; מכל מבודד עם קרח; צינורות וצלחת 24 היטב כדי לאסוף BAL ודגימות רקמה (טבלה 1); מכשירי ניתוח (טבלה 2); פתרונות לבצע BAL ולנקות את הצינורית קנה נשימה ואת המכשירים (טבלה 1).

2. צנתור לב ימני

עכבר לשקול שימוש בסולם דיוק על ידי צבת עכבר בעדינות לתוך שוקל בשיבולת שועל. הקפד לטפל בבעלי החיים בעדינות ובשקט. הקלט משקל. הפרוטוקול המתואר עובד הכי טוב עבור עכברים שהם 20 גרמו או יותר בגלל הקוטר של עורק הצוואר צריך להכיל את הקטטר הלחץ; אפשר צנטר עכברים קטנים יותר (17 גרם או יותר), כל עוד הווריד גדול מספיק.
לטשטש את העכבר באמצעות הזרקת Avertin תלוי במשקל הגוף (10 μl / g), לדוגמה, עבור 20 גרם לתת 200 μl, ל25 גרם לתת 250 μl, עבור 30 גרם לתת 300 μl. נפח ההזרקה המדויקת צריך להיות מותאם בהתאם לזן העכבר. הקפד לטפל בבעלי החיים בעדינות ובשקט, כי מתח יכול לשנות את התגובה לחומרי ההרדמה.
ברגע שהעכבר מסומם, מניח על נייר טישו כפול קפלים. שים לב למספר תעודת הזהות על נייר. לשפשף בעדינות קרם להסרת שיער להיבט הגחון של הצוואר כדי לנקות את שדה הניתוח. הנח את העכבר חזרה על נייר ולחכות 1-2 דקות.
הסרת שיער מהיבט הגחוןשל הצוואר על ידי מלטף את השיער נגד כיוון צמיחת השיער בעדינות עם צמר גפן.
זהירות לקבוע את העומק המספיק של הרדמה בבדיקה להיעדר רפלקס בוהן: העכבר לא מגיב לצביטות האצבעות שלה.
עבודה במהירות ובנינוחה, את שארית צנתור הלב הימני לא אמורה לקחת יותר מ 10 דקות, 3-6 דקות בצורה אופטימלית. חשובה שהרקמה לא תתייבש כי הצנתר צריך להחליק לתוך הווריד ולנוע בתוך הווריד על שכבת לחות. תזמון עקבי של ההליך הוא חשוב עבור הדור של נתונים שאינם ברים השוואה בין קבוצות.
גב עכבר מקום על נייר טישו והעברה בנייר טישו על קלקר לוח. תקן את כפות רגליים וראש למקומו באמצעות קלטת חיטוי.
הפוך חתך של עור מלסתות לעצם חזה (שד עצם).
זהירות לנתח את מעלה הגדול בבלוטת התריס כלפי הצבתות לחשוף את עורק הצוואר הימניnd קנה נשימה.
מקום קלקר הלוח מחזיק את העכבר מתחת למיקרוסקופ לנתיחה במטוס המוקד כבר במקום ועדשה בכ 0.8x הגדלה (גדלה מוחלטת [x חתיכת עדשת עין] הוא כ 8x.
זהירות microdissect וריד צוואר הזכות על ידי הסרת רקמות חיבור המקיפים עם מלקחיים כירורגיים.
מקום שתי חתיכות של תפרים על גבי עורק הצוואר הימני. לקשור את התפר הקרוב ללסתות כדי לסגור את זרימת דם בווריד לטפטוף זעיר, הנח את התפר שהוא קרוב ביותר לעצם החזה / שד העצם בקשר רופף מסביב לווריד. אפשר להשתמש בטפטוף הזעיר של דם מאוחר יותר כדי למצוא את החור בווריד, זה צריך להיות נחוץ.
לנשום ולהירגע (לשחרר את השרירים בצוואר והלסת) כדי לשמור את העיניים על הווריד דרך עיני. זה יבטיח שהידות ואצבעות יהיו להעביר באופן מאובטח, בצורה חלקה ונינוח. בעוד מחזיק את הווריד עם מלקחיים בצד הקרוב להלסתות, לחתוך חור לווריד בין שני התפרים באמצעות מייקרו מספריים המופעלים על ידי היד השנייה. תוריד את מייקרו מספריים, ושמירה שרגועת יד, מרגיש לקטטר. בעדינות לשלוף את הקטטר מחזיק אותו בין אגודל והאצבע הראשונה (איור 3). הכנס את הקטטר אל תוך החור של הווריד.
עדינות קידום הצנתר לתוך הלב הימני (איור 3). שימו לב לסימנים בקטטר שייתן מדד משוער של כמה רחוק קטטר צריך להיות מוכנס ולהתבונן בצג. ברגע עקומות הלחץ מוצגות, בעדינות להדק את התפר הנמוך סביב קטטר. בגלל קטטר יש חוזק מתיחה שנותן לו סליל, וכי קצב הנשימה ולב של העכבר להוסיף תנועה, בנוסף לקבע את הקטטר באמצעות קלטת.
מדידות שיא לחץ ל2 דקות לניתוח מאוחר יותר (איור 4).
פתח את התפר מחזיק קטטר, ואז בעדינות retrieve קטטר. נגב את החלק מאחורי מתמר לחץ, למקם אותו בחזרה לתוך הכוס עם מים. אל תיגע במתמר הלחץ.
העבר את העכבר על גבי נייר הטישו לאזור להמתת חסד, אוסף של רקמת דם וטחול. נקה מכשירי ניתוח.
התחל את התהליך עם בעלי החיים הבאים. כאשר העיתוי מתיר, מזריק חומר ההרדמה בזמן המתנה כדי להקליט את עקומת לחץ (2.15).

3. איסוף דגימות דם וטחול

הזרק barbiturate פתרון, 400 μl לעכבר ולחכות 1-2 דקות. זו מבוצעת באופן שגרתי במעבדה שלנו, כדי למנוע את האפשרות שעכברי טעות להתאושש מAvertin-הרדמה בעת היותו דמם. התקינה המתאימה של ניסוי מושגת על ידי הזרקת המנה הזהה של חומר הרגעת פתרון לעכבר, ועל ידי מתנה את אותה הכמות של זמן לפני הקציר של דם. אם מותר בטיפול בבעלי החיים המוסדי והשתמש ועדה ועוד החיות במעקב צמודות לעומק של הרדמה לפני exsanguination, צעד זה יכול להיות מושמט.
הפוך חתך לתוך הבטן. פתח את וריד הזנב (וריד נבוב) ולאסוף דם באמצעות פיפטה העברה.
הסר את הטחול, או חתיכת הטחול לתוך צינור אפנדורף והקפאת צמד בחנקן נוזלי, או לתוך הצלחת גם 24 לחוצץ גם מכיל הנקס להכנה מאוחר יותר של תאים בודדים.
העבר את העכבר על גבי נייר הטישו לC עבודת שטח לאיסוף BAL, ימפה ריאות ניקוז, ריאות ורקמות לב. נקה מכשירי ניתוח.

4. אוסף של ריאות ולב דוגמאות

מנתח את קנה הנשימה החופשית של שרירים ורקמות חיבור. מלקחיים אותו תחת קנה הנשימה, דרך למשוך תפר. עדינות לייצר מתיחה מספיק כדי לחתוך חור. שמירה על המתיחה העדינה, הכנס את הצינורית של קנה הנשימה באמצעות תנועה מעט מפנה, ותפר הצינורית into מקום. להחדרה של צינורית קנה נשימה, לוודא שקנה הנשימה לח, אם יש צורך מוסיף טיפה של פתרון הנקס. במהלך ההליך, לנשום, להירגע צוואר ושרירי לסת, כדי לשמור על תנועות ידות בטוחות וחלקות.
לנתח לפתוח את כלוב צלעות על ידי הסרת שד העצם החל מתום הבטן בזהירות. נא לא להפריע את התוכן של בית החזה, כי זה עושה את זה מאוד קשה למצוא לימפה.
בצע רונכואלוואולרית שטיפה (BAL) על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ הנקס בעדינות, בעדינות להפוך את המזרק ולאחזר נוזל BAL. חזור 3 פעמים, צינור ומקום קרוב על קרח. במהלך ההליך, לשמור על עיניים בקצה הצינורית של קנה הנשימה המתחברת למזרק. מבט לבית החזה להתבונן האינפלציה והדפלציה של הריאות.
צומת קציר ריאות הלימפה ידי החזקת קיר כלוב צלעות עם סט אחד של מלקחיים, מציאה ואחזור ימפה עם מלקחיים עוד. ימפה מקום לצלחת גם 24. חשוב kעכשיו איפה לחפש: החל מהצוואר, למצוא את הכניסה של כלוב הצלעות בצד הימני של העכבר ונראה מעל עמוד השדרה (איור 5).
לב קציר ומניח על נייר טישו. לבודד את הלב הימני על ידי ביתור בזהירות לאורך המחיצה. העברה לעבודה באזור לשקול, רשום את המשקל והמקום לתוך צינורות Eppendorf לצלם הקפאה בחנקן נוזלי.
הנח תפר סביב אונת הריאה השמאלית כדי לסגור את הסמפונות הראשית. מנתח את אונת הריאה השמאלית החופשית, מקום לצינור אפנדורף והקפאת צמד בחנקן נוזלי, או מקום לטוב של צלחת 24 היטב המכילה פתרון הנקס לבידוד מאוחר יותר של השעיות תא בודדות.
הכנס כ. 0.5 מ"ל בופר פתרון פורמלדהיד דרך הצינורית קנה נשימה לאונות הריאה הנותרות. לאחר אינפלציה, לנתח את אונות ריאה מבית החזה והמקום לתוך שפופרת המכילה 50 מיליליטר תמיסת פורמלדהיד. לתכנון מחקר חלופי, הריאות יכולות להיות מנופחות עם optimal חיתוך התקשורת (אוקטובר, דילול 01:04 עם PBS) ולהקפיא בתבנית המכילה אוקטובר החי להכנה מאוחר יותר של חלקים קפואים. תכנון מחקר נוסף עשוי להצריך השגת רקמה קפוא צמד ריאות והשעיות תא בודדות מהריאות. במקרה זה, אין אינפלציה היא הכרחית: לנתח את אונות ריאה הנותרות; אחזר אותם לבית החזה והמקום לצלחת גם 24 לחוצץ הנקס גם מכיל.
הסר צינורית קנה נשימה, נקיה על ידי שטיפה עם חיץ הנקס, לנקות מכשירי ניתוח.

5. ניתוח עקום לחץ שנוצר מצנתר הלב הימני

נתוני הלחץ הוקלטו חדרית מנותחים באמצעות 7 תוכנת LabChart ללא כל ידע בזהות הקבוצתית של כל הקלטה. יותר מ 20 עקומות נבחרות באופן אקראי וההבדל בין לחץ מקסימאלי והמינימאלי של חדר לכל עקומה נמדד (ΔP). ΔP הממוצע מחושב לתת זכות vלחץ הסיסטולי entricular.