在小鼠睾丸活体显微注射和电穿孔

摘要

本文介绍了显微注射和小鼠睾丸中电在体内的睾丸小鼠细胞转染技术，研究精子的独特工艺。所提出的方案涉及以下步骤:玻璃毛细管制备，经由输出管显微注射，并通过电穿孔转染。

摘要

该视频和文章贡献给了显微注射和小鼠睾丸在体内电穿孔的全面描述。睾丸小鼠细胞这种特殊的转染技术使精子发生过程中的独特的研究。

以下协议侧重于睾丸小鼠细胞与质粒构建体转染。具体而言，我们所用的报告载体pEGFP-C1，其表达增强的绿色荧光蛋白（EGFP），也是pDsRed2-N1载体表达红色荧光蛋白（的DsRed2）。两个编码报道基因是人巨细胞病毒立即早期启动子（CMV）的控制下。

对于执行基因转移到小鼠睾丸中，记者质粒构建注入活老鼠的睾丸。为此目的，一个麻醉动物的睾丸被暴露和显微注射的部位制备。我们首选的地方注射是在输出管，与最终连接睾丸网作为睾丸和附睾的精子的解剖运输路线。以这种方式，微注射后的生精小管的填充物被很好地管理和控制由于使用了染色的DNA溶液。其颜色的小管结构观察睾丸足够的填充后，器官被电穿孔。这使该DNA溶液转移入睾丸细胞。在温育后3天，睾丸被除去，在显微镜对绿色或红色荧光下的调查，表示转染的成功。

通常，该协议可以使用用于递送DNA-或RNA-构建体活小鼠睾丸以（过量）表达或敲除基因，促进体内基因功能分析。此外，它适用于研究报道构建或推定的基因边条保守党元素。因此，电穿孔技术的主要优点是快速的性能在低工作量以及在温和的技术设备和技能的组合所需的相比，替代技术。

引言

哺乳动物精子发生被认为是自我更新的干细胞连续地进行有丝分裂，减数分裂和分化，以发育成成熟的单倍体精子的一个复杂的过程。这些形态变化是由不同类型的细胞编排和尽管深刻的尝试，但仍然不可能在细胞培养^1,2模仿这些过程。因此，在精子发生到现在为止的研究依赖于生物体的体内模型。在一般情况下，基因功能研究通常是基于转基因动物。然而，产生和维持这种动物模型是费时，高成本的并且相当复杂的。这归因于需要长期饲养过程中，用于生成和维持该转基因在世代。另外，通过转基因或基因敲除方法的整个有机体的基因操作容易，当靶向克造成生理损伤埃内斯在多个地区， 例如基本功能外睾丸或全身。

此外，一些瞬时转染方法与一些重要的缺点有关。例如，病毒介导的基因转移的典型缺点是免疫反应及其他安全法规的可能的挑衅，而脂质体³和微粒轰击⁴可能会损坏组织和被限定在一定的细胞深度足够的转染效率。

相反，电穿孔（EP）作为瞬时转染的另一种常见的方法，好像构成一个有前途的技术，为使在体内转染的和一致的体内基因分析。在一般情况下，EP被称为动态现象，它取决于当地的跨膜电压与纳秒内从而介导孔。这些差距可以维持毫秒，足以吨Ø授予访问权限的DNA，RNA或小分子^5。当所施加的电压太高，EP的通常是短暂的字符是由于产热和感应太全面透化与所述小区⁵的随后的不可逆的损伤的抵消。

这里，我们表明，电穿孔是一种有效的和经济的转染系统，其能够被用于遗传睾丸转化为了阐明体内睾丸基因特征。本文介绍质粒制备，注射通过输出管和小鼠睾丸的后续电。这个过程可以是选择实现小鼠睾丸体内的生精小管的快速，特异性和高效的转染为了研究精子发生的过程的手段。

研究方案

所有进行的动物实验已获得当地伦理委员会（Landesamt献给Landwirtschaft，Lebensmittelsicherheit UND Fischerei，梅克伦堡 - 前波莫瑞州，德国）。

1质粒制备

1. 质粒制备，使用质粒纯化试剂盒（参见材料表）或类似方法与内毒素去除缓冲液，使得能够避免动物的免疫反应。按照说明书的指示。采用DDH _{2 O}稀释质粒的解决方案。
2. 通过旋转的DNA溶液以最大速度（20,000 XG）消除碎片。然后收集上清液。
3. 确定质粒浓度用分光光度计（见材料）。
4. 调整质粒浓度DDH _{2 O}的1-3微克（DNA）/微升。注:低浓度会降低转染效率，而高浓度可能会导致太粘注射液。此外，该转染效率依赖于质粒的大小，并进行单独测试。
5. 在注射前，制备溶液混合以例如40微升质粒连同5微升PBS（10×）和5μl坚牢绿（0.5％）。坚牢绿需要跟踪注射过程。最好用薄壁PCR管或封口膜。注:根据睾丸的大小，20〜50微升的体积将需要为每个睾丸。

2，准备显微注射移液器的

1. 用硼硅毛细管（见材料表）编制显微注射移液器。
2. 拉玻璃毛细管垂直毛细管拉马（见材料表）。
3. 通过轻轻地绑扎打破毛细管末端用钳子。尖端通常在50-80微米的直径和1厘米左右长的。尽量避免太长，因为这些是不够坚硬穿透组织技巧。
4. 最后，沙通过使用微量倒角（见材料表）在30°尖rpen以45°角。
5. 加载显微注射移液管的注射溶液混合（见质粒的制备）。将溶液放入玻璃毛细管的背面用小注射器。注意:尽量避免气泡而加载，否则它们将被注入到生精小管沿与质粒溶液，因而会降低导电性，以及可能导致组织损伤。

3，麻醉和手术

1. 通过使用无菌的材料（ 即，注射器，针，外科器械等）进行无菌条件下操作。这将减少动物的感染，并确保良好的存活率。
2. 用雄性老鼠电在6-8周的时代。
3. 初始化术后镇痛治疗，提供了鼠标止痛药加在手术前一天的饮用水。这马屁URES的情况下，极有可能手术后hypodipsia（减少水的摄入量）的超前镇痛。为此，露出饮用水例如儿科布洛芬悬浮液（20毫克/毫升）。本药膳饮水也应在一天之内和两个复苏相同浓度的供给。这意味着，每日剂量为7.5毫克/千克，有效期为5毫升/ð饮用水和体重25克为8岁的C57BL / 6J星期。这镇痛方案保证了基本的缓解疼痛，并伴随着高福利²⁶加速复苏。
4. 用于制备麻醉工作手术当天溶液，混合10％氯胺酮和2％赛拉嗪的比例为1:1（见材料表）。
5. 麻醉动物，适用0.25毫升/ 100毫克体重麻醉剂溶液皮下注射（氯胺酮=0.125克/公斤;赛拉嗪= 0.025克/千克）。使用骨盆和肢体之间的注射部位以防止小鼠的器官损害和伤害。通常，10分钟，需要直到鼠标深度麻醉。
6. 涵盖鼠标眼睛兽医药膏，以防止麻醉过程中干燥。
7. 测试深麻醉逮捕，这是完全没有反应明显。为此，只需夹住动物的脚趾。
8. 要启动手术，取出腹腔头发用电动剃须刀或类似的消毒与sterilium或类似的操作区域。
9. 做腹部切口在腹部中心的包皮腺的正上方。在那个地方，首先拉扯皮肤路程，进行约8-14毫米的小的横向皮肤切口。然后，继续沿腹部肌肉层。
   注意:病变应尽可能小，以减少伤害的动物。
10. 拉起腹部脂肪垫小心露出附睾丸，将其放在事先准备好的防水一次性纸悬垂只是旁边的切口部位（ 图2A）。
11. 使用双筒望远镜到fIND的输出管的注入目标。动脉导管传出被确定为睾丸和附睾的细槽的交界处。它位于邻近突出睾丸动脉。动脉导管几乎运行在45°到动脉的角度和明显进入附睾头部。注:根据鼠标的年龄，动脉导管通常是埋藏在脂肪组织中。
12. 用细镊子清除这个脂肪组织的输出管。在这之后，放置在无菌纸带的释放导管，以确保管道的清晰的可视性不损害环境。

4，显微注射和DNA应用

1. 连接显微注射吸管，其被装载用质粒溶液的显微/喷射器单元。
2. 放置平行于输出管与尖端指向睾丸（ 图2B）的显微注射针。
3. 用细镊子和剥离管在显微注射吸管。确保在毛细管被保持平行于管道而拉过来。
   注意:此过程比通过移动针的穿透显微血管更方便。
4. 小心地引导所述针朝向睾丸和停止仅仅因为它直接穿透白膜（ 图2C）的下方睾丸网。
   注意:在越轨睾丸网的情况下，将质粒溶液会漏入间隙空间。这通常会导致转染的曲细精管的故障。
5. 用于注射的质粒溶液的利用微量注射器具有以下设置:圆周率:100百帕斯卡以下，Ti:0.2秒，和pc:0百帕（ 图2D）。
6. 监控通过观察睾丸填充状态与绿色的帮助下，整个注射过程。注意使睾丸仅填充至其与复量的三分之二asmid解决方案（ 图2E）。
   注意:如果注射量超标，睾丸组织可能受到伤害。

5，电穿孔睾丸

1. 为了实现有效的电，浸泡镊子电极在PBS（1X）。这可确保足够的电导。
2. 顺利地挤在湿电极（ 图2F）之间的睾丸。测量与所述电穿孔仪的电阻。
3. 适用于当前的睾丸。执行八方形脉冲，在40 V在4个不同的睾丸部位以50毫秒的脉冲时间950毫秒的间隔时间恒定的持续时间。

6，伤口愈合和手术后

1. 当电穿孔完成后，将睾丸放回原来的位置。
2. 缝的内肌肉层用手术用缝合线（见材料）。
3. 通过采用缝合夹（见材料表）合皮肤。拉扯皮肤机智ħ镊子。请务必排除肌层。放置剪辑，每个在不超过5mm的距离。
   注:由于手术缝合线可以通过鼠标来吞食，缝合剪辑青睐封闭患处皮肤。
4. 让鼠标从麻醉中恢复无菌纸巾放置在无菌空鼠笼，这是锻炼在37℃的温水垫。该垫应确保的二分之一的笼产生的热梯度的变暖。对于动物这使得能够搜索的个体，最舒适的区域，由于温度变化，在保持架。此外，覆盖了鼠标的无菌纸巾的片材，使得应力可进一步减小。注:由于鼠标的机身表面采用非同寻常的高相对于体量，与较大的动物相比，热的支持是对啮齿动物的成功恢复特别重要的意义。
5. 当操作的动物已经完全觉醒，传送I吨进一步恢复到一个完全配备新的鼠笼。不要把动物恢复到旧笼或一组老鼠​​。确保轿厢是作为清洁和消毒，尽可能防止伤口感染。监测整个恢复过程。要传输的鼠标背部的动物护理设施，等到它已经完全康复，并出现正常的行为。
   注:其他per-和手术后的战略是通过普里切特，康宁KR 等 ⁶所讨论。

结果

实验的设置，用于根据该协议在体内进行注射小鼠睾丸和电穿孔，因为它是用在图1中示出，尽管它有可能获得工业化生产的微量，我们优选的，以产生我们自己的移液管通过拉动（ 图1A ）和坡口（ 图1B）的玻璃毛细管，使它们嵌合我们的需要。示出在图1C中的设备用于显微注射和电穿孔。对转染效率的原因，这是重要的，利用方波电穿孔?...

讨论

研究在生殖生物学领域，特别是在男性生育能力和精子发生不可避免的区域依赖于生物体。为了检查睾丸功能，没有足够的细胞培养/ 体外系统已经建立能够反射从二倍体精原细胞为单倍体成熟精子^1,2的所有关键的形态变化的。因此，转基因动物的产生往往是必要的，在男性生殖生物学这样一个有价值的工具。为此，有相当多的转基因，基因敲除和基因敲除小鼠已建立?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Sigma	1-15 PK
Spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Micropipette puller	Narishige	PC-10	vertical capillary puller
Microinjection capillaries	Clark	GC100-10	borosilicate standard wall
Micropipette beveler	Bachofer	Typ 462	rotating disk beveler
Electroporator	Nepagene	CUY 21EDIT	square wave electroporator
Tweezer electrodes	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø disk electrodes
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
Cold light source	Zeiss	KL 1500LCD
Microinjection pump	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulator	homemade		XYZ cross table
Surgical instruments	FST		scissors, forceps, needle holder
Fine forceps	FST	Dumont #5, #7	efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler	FST	Michel, 12029-12
Michel suture clips	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
Surgical suture	Catgut, Markneukirchen, Germany	Catgut 00
Syringe with 30 G needle	B. Braun	Omnican 40	to load micropipette and for anesthesia
Plasmid isolation kit	Promega	Cat. # A2495	plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye	Sigma	F7258-25G	for dilution in ddH2O
10% Ketamine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Urotamin	mix in a rate 1:1 with xylazine
2% Xylazine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Xylazin	mix in a rate 1:1 with ketamine
Sterilium	Bode Chemie	Sterillium	disinfection
Vet ointment	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	opthalmic ointment to prevent eye dryness
To-Pro-3 iodide	Invitrogen	T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl	Carl Roth	3957.1
Ibuprofen, Dolormin	Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany	01094902	analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief
27 mM KCl	Carl Roth	6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O	Carl Roth	T106.2
18 mM KH2PO4	Carl Roth	3904.1