マウス精巣の生体内マイクロインジェクションやエレクトロポレーションで

要約

この記事では、精子形成のユニークなプロセスを研究するために精巣マウス細胞のトランスフェクション技術としてインビボでマウス精巣のマイクロインジェクションやエレクトロポレーションについて説明します。提示されたプロトコルは、ガラスキャピラリーの準備、輸出管を経由してマイクロインジェクション、エレクトロポレーションによるトランスフェクションの工程を含む。

要約

このビデオでは、物品の寄与はマイクロインジェクションおよびin vivoでのマウス精巣のエレクトロポレーションの包括的な説明を提供します。精巣マウス細胞のこの特定のトランスフェクション技術は、精子形成におけるユニークなプロセスの研究を可能にします。

以下のプロトコルは、プラスミド構築物で精巣マウス細胞のトランスフェクションに焦点を当てています。具体的には、強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）および赤色蛍光タンパク質（DsRed2の）を発現するpDsRed2-N1ベクターを発現するレポーターベクターのpEGFP-C1を用いた。両方の符号化されたレポーター遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（CMV）の制御下にあった。

マウスの精巣への遺伝子導入を行うために、レポータープラスミド構築物は、生きているマウスの精巣に注入される。そのために、麻酔した動物の精巣を露出し、マイクロインジェクションの部位を調製する。当社の優先場所注射は、精巣および精巣上体の間に精子の解剖輸送ルートとして、最終的に接続された精巣網で、輸出管である。このように、マイクロインジェクション後の精細管の充填が良好に起因染色DNA溶液の使用を管理および制御される。その色の細管構造によって精巣の十分な充填を観察した後、臓器をエレクトロポレーションされています。これは、精巣細胞へのDNA溶液を転送することができます。インキュベーションの3日後、精巣を除去し、そしてトランスフェクションの成功を示す、緑色または赤色蛍光について顕微鏡下で調べた。

一般的に、このプロトコルは、DNAまたはRNA-を配信するために使用することができるが、するために生きているマウスの精巣に構築（オーバー）を発現またはin vivo遺伝子機能解析に容易に遺伝子をノックダウン。さらに、レポーター構築物又は推定上の遺伝子レグラを研究するのに適しているトーリー要素。このように、エレクトロポレーション技術の主な利点は、低労力と組み合わせて、高速なパフォーマンスだけでなく、代替技術と比較して必要な適度な技術設備とスキルです。

概要

哺乳動物の精子形成を連続して成熟した半数体精子へと発展させるために、有糸分裂、減数分裂および分化を受けている自己再生幹細胞の洗練されたプロセスであると考えられる。これらの形態学的変化は、異なる細胞型によって編成され、深遠な試みにもかかわらず、それは細胞培養^1,2に、これらのプロセスを模倣することは不可能である。そのため、今までの精子形成の研究は、in vivoモデルとして生物に依存しています。一般に、遺伝子機能の研究は、通常、トランスジェニック動物に基づいている。しかしながら、動物モデルのこの種を生成し、維持することは時間がかかり、コストがかかり、非常に精巧である。これは、世代にわたって導入遺伝子を生成し、維持するために必要な長い育種プロセスに起因する。グラムをターゲットにするとさらに、トランスジェニックまたはノックアウトアプローチによる生物全体の遺伝子操作は、生理的障害を引き起こす傾向がある複数の地域に不可欠な機能を備えたエン例えば 、精巣の外側または全身。

さらに、いくつかの一過性のトランスフェクション法は、いくつかの重大な欠点に関連している。リポフェクション³および微粒子ボンバードメント^4が組織に損傷を与える可能性があり、十分なトランスフェクション効率のための特定のセルの深さに制限されているのに対し、例えば、ウイルス媒介遺伝子導入の典型的な欠点は、免疫反応および追加の安全規制の可能挑発である。

これとは対照的に、一過性トランスフェクションの別の一般的な方法として、エレクトロポレーション（EP）は、 生体内でトランスフェクションおよび一貫性のあるin vivoでの遺伝子解析に有効にするための有望な技術を構成しているようだ。一般的に、EPはナノ秒以内に結果的に媒介される細孔を有するローカル膜貫通電圧に依存する動的な現象と呼ばれている。これらのギャップは、ミリ秒間維持することができ、十分なトンO DNA、RNA、または小分子⁵へのアクセス権を付与します。印加電圧が高すぎると、EPの通常は一時文字は、熱産生およびセル⁵の結果として不可逆的な損傷があまりにも包括的透過性の誘導に打ち消される。

ここでは、エレクトロポレーションは、in vivoでの精巣の遺伝子特性を解明するために、遺伝的精巣形質転換のために利用されることができる効果的かつ経済的なトランスフェクション系であることを示している。この記事では、輸出管およびマウス精巣のその後のエレクトロポレーションを介したプラスミド調製、マイクロインジェクションに対応しています。この手順は、精子形成の過程を調べるために、in vivoでのマウス精巣の精細管の、速く特異的かつ効率的なトランスフェクションを達成するための最適な手段となり得る。

プロトコル

すべて行った動物実験はローカル倫理委員会（LandesamtエリーゼLandwirtschaft、LebensmittelsicherheitウントFischerei、メクレンブルク=フォアポンメルン州、ドイツ）によって承認されている。

1プラスミドの準備

1. 動物の免疫反応を回避することができるように、プラスミド調製のために、エンドトキシン除去緩衝液を用いてプラスミド精製キット（材料テーブルを参照）、または類似の方法を使用する。マニュアルの指示に従ってください。プラスミド溶液を希釈するためのddH ₂ Oを使用する。
2. 最高速度（20,000×g）でDNA溶液を紡糸して破片を除去します。その後、上清を回収。
3. 分光光度計（資料を参照）、プラスミド濃度を決定する。
4. 1-3μgの（DNA）/μlにのddH ₂ Oを有するプラスミド濃度を調整します。注：より高い濃度があまりにも粘性の注射液が発生する可能性がありながら、より低い濃度では、トランスフェクション効率が低下します。加えて、トランスフェクション効率は、プラスミドの大きさに依存し、個別にテストされなければならない。
5. 注射の前に、例えばで5μlのPBS（10倍）と5μlのファストグリーン（0.5％）と一緒に40μlのプラスミドソリューションミックスを準備します。ファストグリーンは、注入プロセスを追跡するために必要とされる。好ましくは、薄壁のPCRチューブあるいはパラフィルムを使用しています。注：精巣のサイズに応じて、20〜50μlの容量は、各精巣のために必要とされる。

マイクロインジェクションピペットの作製

1. マイクロインジェクションピペットを調製するためのホウケイ酸毛細血管を（材料の表を参照）を使用します。
2. 垂直キャピラリープラーとガラスキャピラリーを引いて（材料の表を参照）。
3. そっとバンディングによって鉗子でキャピラリー先端ブレーク。チップは通常、50〜80ミクロン、直径が約1センチです。これらは、組織を貫通するのに十分な剛性ではないので、長すぎるのヒントを避けるようにしてください。
4. 最後、舎で（材料の表を参照）マイクロピペットbevelerを使って、30°〜45°の角度で先端部をrpen。
5. 注射液ミックス（プラスミドの準備を参照）、マイクロインジェクションピペットをロードします。小さなシリンジでガラスキャピラリーの背面に解決策を適用します。注：導電率を低下させるだけでなく、場合によっては組織の損傷の原因となりますので、それ以外の場合、これらはプラスミド溶液と一緒に精細管に注入され、ロード中に気泡を避けるようにしてくださいと。

3麻酔と手術

1. 無菌材料（ すなわち、注射器、注射針、手術器具など）を使用して、無菌状態で操作を実行します。これは、動物の感染を低減し、良好な生存率を確保する。
2. 6-8週齢でエレクトロポレーションのための雄マウスを使用してください。
3. 術後鎮痛治療を初期化するには、鎮痛薬で、マウスを提供する手術前に日に飲料水を追加しました。このお尻可能性が高い手術後hypodipsia（減少取水）の場合、先制鎮痛をURES。この目的のために、例えば、小児イブプロフェン懸濁液（20 mg / ml）を用いて飲料水を露出させる。薬用飲料水も初日と同一の濃度の回復の2に供給してください。これは、C57BL / 6J歳8週間25グラムの5ミリリットル/ dの飲料水や体重の有効な7.5 mg / kgを一日量を意味する。この鎮痛レジメンは、根本的な痛みの軽減と高福祉²⁶と一緒に加速し、回復を保証します。
4. 1の比率（材料表を参照）。手術当日麻酔作業溶液を調製するために、1で10％ケタミンおよび2％キシラジンを混ぜる。
5. 動物を麻酔するためには、0.25ミリリットル/麻酔液を皮下（;キシラジン= 0.025グラム/ kgのケタミン=キロ0.125グラム/）100mgの体重を適用します。マウスの臓器障害や怪我を防ぐために、骨盤および四肢の間に注射部位を使用してください。通常、10分が必要とされているマウスまで深く麻酔をかけている。
6. 麻酔中の乾燥を防ぐために、獣医軟膏をマウスの眼をカバー。
7. 応答の完全な欠如による顕著です深い麻酔停止を、テストします。そのためには、単に動物のつま先を挟ま。
8. 手術を開始するには、電気シェーバーまたは同様に腹部の毛を除去し、steriliumまたは類似した動作領域を消毒。
9. 直接腹部領域の中心にある包皮腺上記腹側切開を加えます。その場所で、第離れて皮を引き、約8〜14ミリメートルの小さな横方向の皮膚のカットを実施しています。その後、腹部の筋肉の層に沿って継続する。
   注：病変は、動物に害を低減するためにできるだけ小さくすべきである。
10. 添付の精巣を露出し、ちょうど切開部位（ 図2A）の横に先立って準備された防水使い捨ての紙のドレープの上に配置するために慎重に腹部の脂肪パッドを引き上げます。
11. a〜fの双眼鏡を使用してください注入の対象となる輸出管をケガニ動脈管の遠心性は、精巣および精巣上体の間に細かい血管の接合部として識別されます。それは、著名な精巣動脈に隣接して配置される。動脈管は、動脈に45°の角度でほぼ動作し、目に見えて頭の精巣上体に入る。注：マウスの​​年齢に応じて、動脈管は通常、脂肪組織に埋め込まれている。
12. この脂肪組織の輸出管をクリアするために細かい鉗子を使用してください。その後、周囲を損なうことなく、ダクトの明確な視認性を確保するために、無菌の紙片にリリース動脈管を配置します。

4。マイクロインジェクションとDNAの応用

1. マイクロマニピュレーター/インジェクタユニットへのプラスミド溶液がロードされているマイクロインジェクションピペットを、接続してください。
2. 精巣網（ 図2B）の方を向いて先端を輸出管へのマイクロインジェクションの針を平行に配置します。
3. 細かいピンセットを使用して、マイクロインジェクションピペットを介してダクトを取り除く。それを上に引っ張りながらキャピラリーダクトと平行に保たれていることを確認します。
   注：この手順では、マイクロマニピュレーターで針を移動させることにより、容器を貫通するよりも便利です。
4. 精巣に向かって慎重に針を向けると、それが白膜（ 図2C）の直下に精巣網を貫通するのと同様に停止します。
   注：精巣網を行き過ぎることの場合には、プラスミド溶液は、間質空間へ漏れる。これは、一般的に精細管をトランスフェクションの失敗につながる。
5. PI：100ヘクトパスカル、TI：0.2秒、およびpc：0ヘクトパスカル（ 図2D）プラスミド溶液の注射のために以下の設定でマイクロインジェクターを利用する。
6. 緑色の助けを借りて、ステータスを充填精巣を観察することにより、全体の注入プロセスを監視します。精巣にのみ、PLでその体積の3分の2まで充填されていることに注意してくださいasmid溶液（ 図2E）。
   注：注入量を超えた場合、精巣組織が悪影響を受ける可能性がある。

精巣の5。エレクトロポレーション

1. 効果的なエレクトロポレーションを有効にするには、PBS（1×）でピンセット電極を浸す。これには、十分な導電性を保証します。
2. スムーズに湿った電極（ 図2F）との間の精巣を絞る。エレクトロとの電気抵抗を測定します。
3. 精巣に現在適用されます。 50ミリ秒パルス時間と950ミリ秒間隔時間の一定期間を持つ4つの異なる精巣サイトで40 Vの8矩形パルスを実行します。

6。創傷閉鎖とポスト手術

1. エレクトロポレーションが終了すると、元の場所に精巣を配置します。
2. 外科用縫合糸（資料を参照）、内側筋層を縫う。
3. 縫合クリップ（材料表を参照）を採用することにより、皮膚を閉じます。肌アップウィットを引いて時間ピンセット。筋層を除外することを確認します。 5mm以下の距離で各クリップを配置します。
   注：外科用縫合糸がマウスで飲み込むことができるため、縫合糸クリップは、皮膚病変を閉じるため好まれる。
4. マウスは、37℃暖かいパッド上に鍛えている無菌の空のマウスのケージに入れ、滅菌したペーパータオル上麻酔から回復できるようにします。パッドは、熱勾配を作成するケージの半分の温暖化を確実にする必要があります。動物の場合、これが原因ケージ内の温度さまざまな個人、最も快適なエリアを検索することができます。応力をさらに低減することができるように、また、滅菌ペーパータオルのシートでマウスをカバーする。注：マウスの​​体表面は、体重に関連してまれに高いので、より大きな動物と比較した場合、熱支持体は、げっ歯類の正常な回復のために特に重要である。
5. 操作した動物が完全に目覚めたとき、私を転送完全装備新しいマウスケージへのさらなる回復のためのT。古いケージにまたはマウスのグループに戻し、動物を入れないでください。ケージは創傷感染を防ぐために、できるだけ清潔で無菌であることを確認してください。全体回復プロセスを監視します。それは完全に回復し、正常に動作するように表示されるまで、バック動物飼育施設にマウスを転送するには、待ってください。
   注：追加per-と手術後の戦略がプリチェットコーニングKR ら ⁶によって議論されている。

結果

それはプロトコルに従って使用されるように、インビボでマウス精巣のマイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションを行うための実験設定を図1に示されている。それが工業的に製造されたマイクロピペットを取得することができるにもかかわらず、われわれは、引っ張って私たち自身のピペットを生成することが好ましい（ 図1A ）と、彼らは私?...

ディスカッション

生殖生物学の分野での研究が、特に男性の生殖能力と精子形成の分野で、必然的に生物に依存しています。精巣機能を調べるために、充分な細胞培養/ in vitro系は半数体精子成熟^1,2の二倍体精原細胞からのすべての重要な形態学的変化を反映することが可能な確立されていない。このように、遺伝子改変動物の発生がしばしば必要と男性生殖生物学のような貴重な?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Sigma	1-15 PK
Spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Micropipette puller	Narishige	PC-10	vertical capillary puller
Microinjection capillaries	Clark	GC100-10	borosilicate standard wall
Micropipette beveler	Bachofer	Typ 462	rotating disk beveler
Electroporator	Nepagene	CUY 21EDIT	square wave electroporator
Tweezer electrodes	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø disk electrodes
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
Cold light source	Zeiss	KL 1500LCD
Microinjection pump	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulator	homemade		XYZ cross table
Surgical instruments	FST		scissors, forceps, needle holder
Fine forceps	FST	Dumont #5, #7	efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler	FST	Michel, 12029-12
Michel suture clips	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
Surgical suture	Catgut, Markneukirchen, Germany	Catgut 00
Syringe with 30 G needle	B. Braun	Omnican 40	to load micropipette and for anesthesia
Plasmid isolation kit	Promega	Cat. # A2495	plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye	Sigma	F7258-25G	for dilution in ddH2O
10% Ketamine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Urotamin	mix in a rate 1:1 with xylazine
2% Xylazine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Xylazin	mix in a rate 1:1 with ketamine
Sterilium	Bode Chemie	Sterillium	disinfection
Vet ointment	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	opthalmic ointment to prevent eye dryness
To-Pro-3 iodide	Invitrogen	T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl	Carl Roth	3957.1
Ibuprofen, Dolormin	Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany	01094902	analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief
27 mM KCl	Carl Roth	6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O	Carl Roth	T106.2
18 mM KH2PO4	Carl Roth	3904.1