בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

Summary

מאמר זה מתאר microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo כטכניקת transfection לתאי עכבר אשכים ללמוד תהליכים ייחודיים של יצירת תאי זרע. הפרוטוקול המובא כרוך בצעדים של הכנת זכוכית נימים, microinjection באמצעות צינור efferent, וtransfection ידי electroporation.

Abstract

תרומת וידאו ומאמר זה נותנת תיאור מקיף של microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo. טכניקת transfection המסוימת הזה לתאי עכבר אשכים מאפשרת המחקר של תהליכים ייחודיים ביצירת תאי זרע.

הפרוטוקול הבא מתמקד בtransfection של תאי עכבר אשכים עם בונה פלסמיד. באופן ספציפי, אנו משמשים וקטור הכתב pEGFP-C1, המבטא משופר חלבון ירוק ניאון (eGFP) וגם וקטור pDsRed2-N1 לבטא חלבון אדום ניאון (DsRed2). שני גני הכתב המקודדים היו תחת שליטתו של אמרגן ציטומגלווירוס האנושי מיידי מוקדם (CMV).

לביצוע העברת גנים לתוך אשכים עכבר, בונה פלסמיד הכתב מוזרקות לתוך אשכים של עכברים חיים. לשם כך, האשכים של בעלי חיים מורדמים חשופים והאתר של microinjection מוכן. המקום המועדף שלנו שלהזרקה היא צינור efferent, עם אשך ךטה" מחובר סופו של דבר כדרך תחבורה האנטומי של תאי הזרע בין האשך ויותרת האשך. בדרך זו, המילוי של אבוביות הזרע לאחר microinjection מנוהל מצוין ומבוקר בשל השימוש בפתרוני DNA מוכתם. לאחר התבוננות מילוי מספק של האשך על ידי מבנה אבובית הצבעוני שלה, האיבר electroporated. זה מאפשר ההעברה של פתרון דנ"א לתוך תאי האשכים. בעקבות 3 ימים של דגירה, האשכים מוסרים ונחקרים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ירוק או אדום, הממחישים את ההצלחה transfection.

באופן כללי, פרוטוקול זה יכול להיות מועסק להעברת דנ"א או RNA- בונה לאשך עכבר חיים כדי (מעל) להביע או להפיל את הגנים, להקל בניתוח תפקוד גן vivo. יתר על כן, הוא מתאים ללימוד מושגי כתב או regula גן המשועראלמנטי טורים. לפיכך, היתרונות העיקריים של טכניקת electroporation הם ביצועים מהירים בשילוב עם מאמץ נמוך, כמו גם הציוד הטכני המתון וכישורים הנדרשים בהשוואה לטכניקות חלופיות.

Introduction

יצירת תאי זרע של יונקים נחשב לתהליך מתוחכם של תאי גזע עצמי חידוש ברציפות עוברים מיטוזה, מיוזה ובידול על מנת להתפתח לתאי זרע הפלואידים בוגרים. שינויים מורפולוגיים אלה בניצוחו של תאים מסוגים שונים ולמרות ניסיונות עמוקים, זה עדיין בלתי אפשרי לחקות את התהליכים הללו בתא התרבות ^1,2. לפיכך, מחקר על יצירת תאי זרע עד עכשיו מסתמך על אורגניזמים חיים כמודלים in vivo. באופן כללי, מחקרי תפקוד הגן מבוססים בדרך כלל על בעלי חיים מהונדסים. עם זאת, יצירה והשמירה של מודל חיה מסוג זה היא זמן רב, עלות אינטנסיבית ומורכבת למדי. זה מיוחס לתהליך הרבייה הארוך הנדרש ליצירת ושמירה על transgene לאורך הדורות. בנוסף, המניפולציה הגנטית של האורגניזם כולו על ידי הגישה המהונדס או נוק אאוט הוא נוטה לגרום לליקויים פיסיולוגיים כאשר מיקוד גרםenes עם פונקציות חיוניות באזורים רבים, למשל, מחוץ לאשך או מערכתי.

יתר על כן, כמה שיטות transfection חולפות קשורות עם כמה חסרונות קריטיים. לדוגמא, חסרונות אופייניים להעברת גנים בתיווך וירוס הם הפרובוקציה האפשרית של immunoreactions ותקנות בטיחות נוספות, ואילו lipofection ³ וmicroparticle הפגזה ⁴ עלולה לגרום נזק לרקמות ומוגבלות לעומק תא מסוים ליעילות transfection מספיק.

בניגוד לכך, electroporation (EP) כדרך נוספת נפוצה של transfection החולף נראה, להוות טכניקה מבטיחה למאפשר בtransfection vivo וin vivo ניתוח גנטי עולה בקנה אחד. באופן כללי, EP נקרא תופעה דינמית שתלוי במתח הטרנסממברני מקומי עם נקבוביות בתיווך כתוצאה מכך בתוך ננו שניות. t פערים אלה יכולים להישמר במשך אלפיות השניה, מספיקo להעניק גישה לDNA, RNA או מולקולות קטנות ^5. כאשר המתח שיושם הוא גבוה מדי, האופי בדרך כלל החולף של EP הוא נוטרל עקב ייצור חום ואינדוקציה של permeabilization המקיף מדי עם נזק בלתי הפיך הסוגר של התא ^5.

כאן, אנו מראים כי electroporation הוא מערכת transfection יעילה וחסכונית שהוא מסוגל להיות מנוצל לשינוי אשך גנטי כדי להבהיר מאפיינים גנטיים אשכי in vivo. מאמר זה עוסק הכנת פלסמיד, microinjection באמצעות צינור efferent וelectroporation הבא של אשך עכבר. הליך זה יכול להיות האמצעי של בחירה כדי להשיג transfection מהיר, ספציפי והיעיל של אבוביות זרע של אשך עכבר in vivo כדי לחקור תהליכים של יצירת תאי זרע.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים שבוצעו אושרו על ידי הוועדה המקומית האתיקה (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, מקלנבורג מערב פומרניה-, גרמניה).

.1 פלסמיד הכנה

1. להכנת פלסמיד, שימוש ערכות פלסמיד טיהור (ראה טבלת חומרים) או בשיטות דומות עם חיץ הסרת רעלן הפנימי כדי שניתן תהיה להימנע מתגובות חיסוניות של בעלי החיים. בצע את ההוראות של המדריך. להעסיק DDH ₂ O כדי לדלל את פתרון פלסמיד.
2. לחסל את הפסולת על ידי ספינינג פתרון DNA במהירות המרבית (20,000 XG). ואז לאסוף את supernatant.
3. לקבוע את ריכוז פלסמיד עם ספקטרופוטומטר (ראה חומרים).
4. התאם את ריכוז פלסמיד עם DDH ₂ O ל 1-3 מיקרוגרם (DNA) / μl. הערה: ריכוזים נמוכים יפחיתו את יעילות transfection, ואילו ריכוזים גבוהים יותר עלולים לגרום לפתרון הזרקה צמיג מדי. חוץ מזה,יעילות transfection תלוי בגודל של פלסמיד ולהיבדק בנפרד.
5. לפני הזריקה, להכין תערובת פתרון עם לפלסמיד μl דוגמא 40 יחד עם 5 μl PBS (10x) ו -5 ירוקים μl מהיר (0.5%). גרין המהיר נחוץ למעקב אחר תהליך ההזרקה. רצוי, להשתמש PCR-צינורות קיר דקים או Parafilm. הערה: בהתאם לגודל של האשך, בהיקף של 20-50 μl יהיה צורך לכל אשך.

2 הכנת Microinjection פיפטה

1. השתמש בנימי ורוסיליקט (ראה טבלת חומרים) להכנת טפטפות microinjection.
2. משוך נימי זכוכית עם חולץ נימים אנכי (ראה טבלת חומרים).
3. לשבור את קצה נימים עם מלקחיים על ידי ברכות פסים. טיפ הוא בדרך כלל 50-80 מיקרומטר בקוטר ואורכו כ 1 סנטימטר. נסה להימנע מטיפים שהם ארוכים מדי כמו אלה הם לא נוקשה מספיק כדי לחדור את הרקמה.
4. לבסוף, sharpen הקצה ב30 מעלות ל45 ° זווית באמצעות beveler micropipette (ראה טבלת חומרים).
5. טען את פיפטה microinjection עם לערבב פתרון הזרקה (ראה פלסמיד הכנה). ליישם את הפתרון לחלק האחורי של נימי הזכוכית עם מזרק קטן. הערה: נסה להימנע מבועות אוויר בעת טעינה, אחרת אלה יהיו להזריק לתוך אבוביות הזרע יחד עם פתרון פלסמיד, ולכן יפחית את המוליכות כמו גם ואולי לגרום נזק לרקמות.

.3 הרדמה וניתוח

1. לבצע את הפעולה בתנאי ספטית על ידי שימוש בחומר סטרילי (כלומר, מזרק, מחט, מכשירי ניתוח, וכו '). זה יקטין זיהום של בעלי החיים ולהבטיח שיעורי הישרדות טובים.
2. השתמש בעכברי זכרים לelectroporation בגיל 6-8 שבועות.
3. כדי לאתחל טיפול משכך כאבים לאחר ניתוח, לספק את העכבר עם משככי כאבים הוסיף שתיית מים ביום לפני הניתוח. זה התחתures שיכוך כאבים מקדים במקרה של hypodipsia סבירות גבוהה שלאחר ניתוח (צריכת מים פחת). לשם כך, לחשוף את מי שתייה עם למשל השעיה איבופרופן ילדים (20 מ"ג / מ"ל). גם מי שתיית תרופות צריכים להיות מסופק ביום אחד ושתיים מהתאוששות בריכוז זהה. משמעות הדבר היא מנה יומית של 7.5 מ"ג / קילוגרם, תקף למשקל 5 מ"ל / מי שתיית ד וגוף של 25g במשך 8 שבועות בגילי C57BL / 6J. משטר משכך כאבים זה מבטיח הקלה על כאב בסיסית והתאוששות מואצת יחד עם גבוהה רווחה ^26.
4. להכנת ההרדמה עובדת פתרון ביום של ניתוח, לערבב 10% Ketamin ו2% Xylazin ב1: 1 (ראה טבלת חומרים).
5. כדי להרדים את החיה, להחיל משקל גוף 0.25 מ"ל / 100 מ"ג תת עורי הרדמה (Ketamin = 0.125 גר '/ קילוגרם; Xylazin = 0.025 גר' / קילוגרם). השתמש באתר הזרקה בין האגן וגפיים על מנת למנוע נזק לאיברים ולפציעתם של העכברים. בדרך כלל, יש צורך ב10 דקותעד העכבר בהרדמה עמוקה.
6. כסה את עיני עכבר עם משחה וטרינר כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
7. בחן את מעצר הרדמה עמוק, שניכר על ידי היעדר מוחלט של תגובה. לשם כך, פשוט צובט את הבוהן של בעלי החיים.
8. כדי להתחיל את הניתוח, להסיר שיער בבטן עם מכונת גילוח חשמלי או דומה ולחטא את אזור הפעולה עם sterilium או דומה.
9. לעשות חתך הגחון ישירות מעל בלוטות preputial במרכז אזור הבטן. באותו מקום, למשוך ראשון עור משם ולערוך בו קיצוץ רוחבי עורית קטנה של כ 8-14 מ"מ. לאחר מכן, ימשיך לאורך שכבת שרירי הבטן.
   הערה: הנגע צריך להיות קטן ככל האפשר כדי להפחית את הפגיעה בבעלי החיים.
10. משוך את רפידות שומן בבטן בזהירות כדי לחשוף את האשכים המצורפים והנח אותו על וילון לפני מוכן עמיד למים חד פעמי נייר ממש ליד אתר החתך (איור 2 א).
11. להשתמש במשקפת לfind צינור efferent כמטרת ההזרקה. Efferent ductus מזוהה כצומת כלי דקה שבין האשכים ויותרת האשך. הוא ממוקם בסמוך לעורק אשכים הבולט. Ductus פועל כמעט בזווית של ° 45 לעורק ובעליל נכנס epididymidis Caput. הערה: בהתאם לגילו של העכבר, ductus בדרך כלל נקבר ברקמת שומן.
12. השתמש במלקחיים עדינים כדי לנקות את צינור efferent של רקמת השומן הזה. אחרי זה, למקם את ductus שוחרר ברצועת נייר סטרילי כדי להבטיח את הנראות ברורות של הצינור מבלי לפגוע בסביבה.

.4 Microinjection וDNA Application

1. חבר את פיפטה microinjection, אשר נטענה עם פתרון פלסמיד ליחידת micromanipulator / מזרק.
2. מניחים את המחט המקבילה microinjection לצינור efferent עם הקצה והצביע לעבר אשך ךטה" (איור 2).
3. השתמש בפינצטה בסדר ולהפשיט את הצינור מעל פיפטה microinjection. ודא שהנימים נשמרות במקביל לצינור תוך משיכתו מעל.
   הערה: הליך זה הוא נוח יותר מאשר לחדור לספינה על ידי הזזת המחט עם micromanipulator.
4. כוון את המחט בזהירות לכיוון האשכים ולעצור בדיוק כפי שחודר אשך ךטה" ישירות מתחת לalbuginea Tunica (איור 2 ג).
   הערה: במקרה של overreaching אשך ךטה", פתרון פלסמיד ידלוף למרחב הבין. זה מוביל בדרך כלל לכישלון של transfecting אבוביות זרע.
5. להזרקה של פתרון פלסמיד לנצל microinjector עם ההגדרות הבאות: pi: 100 hPa ti,: 0.2 שניות, ומחשב: 0 hPa (איור 2 ד).
6. לפקח על כל תהליך ההזרקה על ידי התבוננות האשך מילוי מעמד בעזרת הצבע הירוק. תשמור על עצמך כי האשך מלא רק עד 2/3 שלה נפח עם plפתרון asmid (איור 2E).
   הערה: אם נפח ההזרקה הוא חריגה, רקמת האשך עלולה להיפגע.

.5 Electroporation של אשך

1. כדי לאפשר electroporation היעיל, לספוג את האלקטרודות פינצטה בPBS (1x). הדבר מבטיח מוליכות נאותות.
2. בצורה חלקה לסחוט את האשך בין האלקטרודות הרטובות (איור 2F). מדוד את ההתנגדות החשמלית עם electroporator.
3. החל נוכחי לאשך. לבצע שמונה פולסים מרובעים של 40 V ב 4 אתרי אשך שונים עם משך קבוע של 50 זמן דופק אלפיות שני ו950 מרווח זמן אלפיות שני.

.6 סגירת פצעים ולאחר ניתוח

1. כאשר electroporation נגמר, הנח את האשכים בחזרה במיקום המקורי.
2. לתפור את שכבת שרירים הפנימית עם תפר כירורגים (ראה חומרים).
3. סגור את העור על ידי שימוש בקטעי תפר (ראה טבלת חומרים). משוך את שנינות העור עדפינצטה h. ודא שלא לכלול את השכבה השרירית. הנח את קטעים, כל אחד במרחק של לא יותר מ 5 מ"מ.
   הערה: מאחר ותפר כירורגים יכול להיבלע על ידי העכבר, קליפים תפר הם העדיפו לסגירת הנגע בעור.
4. אפשר העכבר כדי להתאושש מהרדמה על מגבות נייר סטרילי להציב בכלוב סטרילי ריק עכבר, המזג על משטח חם 37 מעלות צלזיוס. הכרית צריכה להבטיח את ההתחממות של חצי אחד של כלוב יצירת שיפוע חום. לחיה זו מאפשרת לחפש את האזור הבודד, הכי הנוח בשל מגוון הטמפרטורה בכלוב. בנוסף, לכסות את העכבר עם גיליון של מגבת נייר סטרילי, כך שלחץ יכול להצטמצם עוד יותר. הערה: מאחר שמשטח גופו של העכבר הוא גבוה מרגיל ביחס למסת גוף, בהשוואה לבעלי חיים גדולים יותר, תמיכת התרמית היא בעלת חשיבות מיוחדת לשחזור מוצלח של מכרסמים.
5. כאשר בעלי החיים המופעלים התעוררו באופן מלא, להעביר it להמשך התאוששות בכלוב עכבר חדש מצויד לחלוטין. אין לשים את החיה חזרה לכלוב שלה ישן או לקבוצה של עכברים. ודא שהכלוב הוא נקי וסטרילי ככל האפשר כדי למנוע זיהום פצע. לפקח על תהליך ההתאוששות כולו. כדי להעביר את העכבר בחזרה למתקן הטיפול בבעלי החיים, לחכות עד שהוא התאושש לחלוטין ונראה שהתנהג בצורה נורמלית.
   הערה: per- נוסף ואסטרטגיות לאחר ניתוח נדונים על ידי אל פריצ'ט-Corning KR et ^6.

תוצאות

ההגדרה הניסיונית לביצוע microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo כפי שהוא משמש על פי הפרוטוקול מתוארת באיור 1. למרות שזה אפשרי לרכוש micropipettes תעשייתי מיוצר, העדפנו ליצור טפטפות שלנו על ידי משיכת (איור 1 א ) וbeveling (איור 1 ב) נימי זכוכית, כך שהם מצוי...

Discussion

מחקר בתחום הביולוגיה של רבייה, במיוחד בתחום של פריון ויצירת תאי זרע באופן בלתי נמנע זכר מסתמך על אורגניזמים חיים. על מנת לבחון תפקוד אשכים, אין תרבית תאים מתאימה / מערכת במבחנה כבר נקבעה מסוגל משקף את כל השינויים מורפולוגיים המכריעים מspermatogonium דיפלואידי ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Sigma	1-15 PK
Spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Micropipette puller	Narishige	PC-10	vertical capillary puller
Microinjection capillaries	Clark	GC100-10	borosilicate standard wall
Micropipette beveler	Bachofer	Typ 462	rotating disk beveler
Electroporator	Nepagene	CUY 21EDIT	square wave electroporator
Tweezer electrodes	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø disk electrodes
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
Cold light source	Zeiss	KL 1500LCD
Microinjection pump	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulator	homemade		XYZ cross table
Surgical instruments	FST		scissors, forceps, needle holder
Fine forceps	FST	Dumont #5, #7	efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler	FST	Michel, 12029-12
Michel suture clips	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
Surgical suture	Catgut, Markneukirchen, Germany	Catgut 00
Syringe with 30 G needle	B. Braun	Omnican 40	to load micropipette and for anesthesia
Plasmid isolation kit	Promega	Cat. # A2495	plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye	Sigma	F7258-25G	for dilution in ddH2O
10% Ketamine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Urotamin	mix in a rate 1:1 with xylazine
2% Xylazine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Xylazin	mix in a rate 1:1 with ketamine
Sterilium	Bode Chemie	Sterillium	disinfection
Vet ointment	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	opthalmic ointment to prevent eye dryness
To-Pro-3 iodide	Invitrogen	T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl	Carl Roth	3957.1
Ibuprofen, Dolormin	Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany	01094902	analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief
27 mM KCl	Carl Roth	6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O	Carl Roth	T106.2
18 mM KH2PO4	Carl Roth	3904.1