В Vivo микроинъекции и электропорации мыши яичка

Резюме

В этой статье описывается микроинъекции и электропорации мыши яичка в естественных условиях, как техника трансфекции для яичек мышиных клеток для изучения уникальных процессы сперматогенеза. Представленный протокол включает этапы подготовки стеклянной капиллярной, микроинъекции через выводного протока, и трансфекции путем электропорации.

Аннотация

Этот вклад видео и статья дает исчерпывающее описание микроинъекции и электропорации мыши яичка в естественных условиях. Это особая техника трансфекции для яичек клеток мыши позволяет изучение уникальных процессов в сперматогенеза.

Следующий протокол фокусируется на трансфекции яичка клеток мыши с плазмиды конструкций. В частности, мы использовали репортер вектор pEGFP-C1, который выражает повышенную зеленый флуоресцентный белок (EGFP), а также вектор pDsRed2-N1 выражая красный флуоресцентный белок (DsRed2). Оба закодированные гены-репортеры были под контролем цитомегаловируса человека раннего промотора-(CMV).

Для выполнения перенос гена в яичках мыши, репортер плазмидные конструкции вводятся в семенниках, живущих мышей. С этой целью, яичко из наркоза животное подвергается и сайт микроинъекции подготовлен. Наша предпочтительным местоминъекции отводящий канал, с конечном счете, подключенного рете семенников в качестве анатомического транспортного маршрута сперматозоидов между яичка и придатка яичка. Таким образом, заполнение семенных канальцах после микроинъекции превосходно управление и контроль за использованием окрашенных растворов ДНК. После наблюдения достаточное заполнение яичка его цветной структуры канальцев, орган электропорации. Это позволяет передавать раствора ДНК в клетках семенников. После 3 дней инкубации яичка удаляют и исследовали под микроскопом для зеленого или красного флуоресценции, иллюстрирующий успех трансфекции.

Как правило, этот протокол может быть использован для доставки ДНК-или РНК-конструкции в живой мыши яичка для того, чтобы (по) выражают или сбить генов, облегчая в функции гена естественных условиях анализа. Кроме того, он подходит для изучения репортер конструкции или предполагаемый ген РегулаТори элементы. Таким образом, основными преимуществами техники электропорации являются высокая производительность в сочетании с низким усилием, а также умеренного технического оборудования и навыков, необходимых по сравнению с альтернативными методами.

Введение

Млекопитающих сперматогенез считается сложный процесс самообновляющихся стволовых клеток последовательно проходящих митоза, мейоза и дифференцировку в целях развития в зрелом гаплоидном сперматозоидов. Эти морфологические изменения в оркестровке различных типов клеток и, несмотря на глубокие попытки, до сих пор невозможно имитировать эти процессы в культуре клеток ^1,2. Следовательно, исследование сперматогенеза до теперь полагается на живые организмы в качестве моделей для естественных. В общем, функции гена исследования, как правило, основаны на трансгенных животных. Тем не менее, создании и поддержании такой модели на животных является трудоемким, дорогостоящим и достаточно сложной. Это связано с требуемой длительного процесса размножения для создания и поддержания трансген над поколений. Кроме того, генетические манипуляции всего организма трансгенной или нокаутом подхода является склонны вызывать физиологические нарушения при ориентации гены с основных функций в нескольких регионах, например, за пределами яичка или системно.

Кроме того, некоторые переходные способы трансфекции связаны с некоторых важных недостатков. Например, типичные недостатки вируса-опосредованного переноса генов являются возможно провокация immunoreactions и дополнительных правил безопасности, в то время как липофекция ³ и бомбардировки микрочастицами ⁴ может привести к повреждению ткани и ограничены определенной глубине клеток для достаточной эффективности трансфекции.

В отличие от этого, электропорации (EP) в качестве еще ​​одного общего пути временной трансфекции, кажется, представляют собой перспективный метод позволяет в естественных условиях трансфекции и последовательной естественных анализа генов в. В общем, ЕР называют динамическим явлением, которое зависит от местного трансмембранного напряжения с следовательно, опосредованных пор в пределах наносекунд. Эти пробелы можно поддерживать в течение миллисекунд, достаточно то предоставлении доступа к ДНК, РНК или малых молекул ^5. Когда приложенное напряжение является слишком высокой, как правило, временный характер ЕР противодействует за счет производства тепла и индукции слишком комплексной проницаемости с последующей необратимого повреждения клетки ^5.

Здесь мы показываем, что электропорации является эффективным и экономичным система трансфекции который способен быть использованы для генетической трансформации яичка с целью выяснения яичек характеристики генов в естественных условиях. В данной статье рассматриваются подготовку плазмиды, микроинъекции через выводного протока и последующей электропорации мыши яичка. Эта процедура может быть средством выбора для достижения быстрого, конкретную и эффективную трансфекцию семенных канальцах яичек мыши в естественных условиях с целью изучения процессов сперматогенеза.

протокол

Все выполненные эксперименты на животных были одобрены местным комитетом по этике (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit унд Fischerei, Мекленбург-Передняя Померания, Германия).

1 плазмиды Подготовка

1. Для приготовления плазмиды, использовать плазмиды комплекты очистки (см таблицу материалы) или аналогичные методы с буфером удаления эндотоксина так, что иммунные реакции животного можно избежать. Следуйте инструкциям в руководстве. Применять DDh ₂ O разбавить раствора плазмиды.
2. Ликвидировать мусор, крутя раствора ДНК при максимальной скорости (20000 мкг). Затем собирают супернатант.
3. Определить концентрацию плазмиды с помощью спектрофотометра (см материалы).
4. Отрегулируйте концентрацию плазмиды с DDh ₂ O в 1-3 мкг (ДНК) / мкл. Примечание: Более низкие концентрации приведет к снижению эффективности трансфекции, в то время как более высокие концентрации могут вызвать слишком вязкий раствор для инъекций. Кроме того,Эффективность трансфекции в зависимости от размера плазмиды и должен быть протестированы индивидуально.
5. Перед инъекцией, приготовить смесь раствора с, например 40 мкл плазмиды вместе с 5 мкл PBS (10x) и 5 ​​мкл Fast Green (0,5%). Быстрый зеленый необходима для отслеживания процесса впрыска. Предпочтительно, используют тонкие стены ПЦР-пробирки или парафином. Примечание: В зависимости от размера яичка, объем 20-50 мкл будут необходимы для каждого яичка.

2 Получение микроинъекции пипетки

1. Используйте боросиликатного капилляры (см таблицу материалы) для подготовки микроинъекции пипетки.
2. Потяните стеклянные капилляры с вертикальной капиллярной съемника (см Материалы таблицу).
3. Перерыв кончик капиллярной щипцами по мягко диапазонов. Кончик обычно 50-80 мкм в диаметре и длиной около 1 см. Старайтесь избегать советов, которые слишком долго, поскольку они не достаточно жесткой, чтобы проникнуть в ткани.
4. Наконец, шаrpen чаевые в 30 градусов, чтобы угол 45 ° с помощью микропипетки beveler (см таблицу материалы).
5. Загрузите микроинъекции пипетки с микс инъекционного раствора (см Plasmid Подготовка). Нанесите раствор в задней части стеклянного капилляра с маленьким шприцем. Примечание: Старайтесь избегать воздушных пузырьков при загрузке, в противном случае это будет выведена на семенных канальцев вместе с плазмиды решения и, следовательно, снизит проводимость, а также, возможно, вызвать повреждение тканей.

3 Анестезия и хирургия

1. Выполните операцию в асептических условиях, используя стерильного материала (т.е. шприц, игла, хирургических инструментов и т.д.). Это уменьшит заражение животного и обеспечить хорошие показатели выживаемости.
2. Используйте самцов мышей для электропорации в возрасте 6-8 недель.
3. Для инициализации послеоперационный лечение обезболивающее, обеспечить мышь с анальгетиками добавил питьевой воды в день до операции. Это задницуОЭС упреждающий обезболивания в случае высокой вероятностью послеоперационной hypodipsia (впускной уменьшилась воды). Для этого, выставить питьевой воды, например, с педиатрической ибупрофен подвески (20 мг / мл). Лечебные питьевой воды также должны быть поставлены в один день и две восстановления в одинаковой концентрации. Это означает, суточную дозу 7,5 мг / кг, действительный в течение 5 мл / сут питьевой воды и массы тела 25 г в течение 8 недель в возрасте C57BL / 6J. Этот режим обезболивающее гарантирует фундаментальное облегчение боли и ускоренное восстановление наряду с высокой благосостояния ^26.
4. Для подготовки анестезии рабочего раствора на день операции, смешать 10% Ketamin и 2% Xylazin в соотношении 1: 1 (см таблицу материалы).
5. Чтобы анестезию животного, применяют 0,25 мл / 100 мг веса тела анестезирующего раствора подкожно (Ketamin = 0,125 г / кг; Xylazin = 0,025 г / кг). Используйте место для инъекции между таза и конечностей для предотвращения повреждения органов и травмы мышей. Как правило, 10 мин необходимыпока мышь не глубоко под наркозом.
6. Покройте глаза мыши с ветеринарной мази для предотвращения сухости во время анестезии.
7. Проверьте глубокий обезболивающий арест, который заметно по общей отсутствия ответа. С этой целью, просто зажать палец животного.
8. Чтобы начать операцию, удалить животе волосы с электробритва или аналогичный и дезинфицировать работы зона с sterilium или аналогичный.
9. Сделать вентральный вырез прямо над препуциальных желез в центре брюшной области. В том месте, первый потяните кожу в сторону и провести небольшое поперечное кожную срез о 8-14 мм. Тогда, по-прежнему вдоль брюшной мышечного слоя.
   Примечание: Повреждение должно быть как можно меньше, чтобы уменьшить вред животным.
10. Потяните вверх живота жировые отложения тщательно подвергать прилагаемый яичка и поместить его на предварительного подготовленного водонепроницаемый одноразовой бумажной салфеткой только около сайте разреза (Рисунок 2А).
11. Используйте бинокль Fинд в отводящий канал в качестве цели впрыска. Проток эфферентной идентифицируется как тонкой стыке сосуда между яичка и придатка яичка. Он расположен рядом с видного яичка артерии. Проток проходит почти под углом 45 ° к артерии и зримо входит в CAPUT epididymidis. Примечание: В зависимости от возраста мыши, проток обычно похоронен в жировой ткани.
12. Используйте тонкий пинцет, чтобы очистить выводного протока этой жировой ткани. После этого, поместите выпущенный протока на стерильной бумажной полоске, чтобы обеспечить хорошую видимость воздуховода без ущерба окрестности.

4 Микроинъекция и применение ДНК

1. Подключите микроинъекции пипетки, который загружается с плазмиды решения блока микроманипулятор / инжектора.
2. Поместите микроинъекции иглы параллельно выводного протока с кончиком, направленным к рете семенников (Рисунок 2B).
3. Используйте мелкие пинцеты илишить канал над микроинъекции пипетки. Убедитесь, что капилляр удерживаться параллельно к воздуховоду, потянув его.
   Примечание: Эта процедура является более удобным, чем проникнуть в судно, перемещая иглу с микроманипулятора.
4. Направьте иглу тщательно к яичка и остановить как она проникает в рете семенников непосредственно под белочной оболочки (Рисунок 2C).
   Примечание: В случае необоснованных сплетение яичка, плазмиды решение будет просачиваться в интерстициальное пространство. Это обычно приводит к выходу из строя трансфекции семенных канальцев.
5. Для инъекции плазмиды решения использовать microinjector со следующими настройками: пи: 100 гПа, Ti 0,2 сек, и компьютер: 0 гПа (Рисунок 2D).
6. Контролировать весь процесс впрыска, наблюдая яичко заполнения статус с помощью зеленого цвета. Следите за тем, семенников заполняется только до 2/3 его объема с плasmid решение (Рисунок 2E).
   Примечание: Если объем впрыска превышении ткани яичка может быть нанесен вред.

5 Электропорация яичка

1. Для эффективного электропорации, замочить Пинцет электроды в PBS (1x). Это обеспечивает адекватное проводимость.
2. Плавно выжать яичко между мокрыми электродами (Рисунок 2F). Измерьте электрическое сопротивление с электропоратора.
3. Применить ток яичка. Выполните восемь прямоугольных импульсов 40 V в 4 различных местах яичка с постоянным продолжительности 50 мс Время импульса и 950 мс интервала времени.

6 закрытия раны и после операции

1. При электропорации уложите яичко обратно в исходное расположение.
2. Сшейте внутреннюю мышечного слоя с хирургического шва (см материалы).
3. Закройте кожу, используя шовные клипы (см таблицу материалы). Потяните кожи до умач пинцет. Убедитесь, что исключает мышечного слоя. Поместите клипы, каждый на расстоянии не более 5 мм.
   Примечание: Потому что хирургический шовный может быть проглочена мыши, шовные клипы благоприятствования для закрытия повреждение кожи.
4. Разрешить мышь для восстановления после анестезии на стерильных бумажных полотенец, помещенных в стерильную пустую клетку мыши, который закаленного на 37 ° C теплой панели. Подушка должна обеспечивать потепление одной половине клетки, создавая тепловой градиент. Для животного это делает возможным поиск для индивидуального, наиболее удобной зоной в связи с разнообразием температуры в клетке. Кроме того, покрытие мыши с листом стерильной бумажным полотенцем так, что стресс может быть дополнительно уменьшено. Примечание: С поверхности тела мыши является необычайно высокой по отношению к массе тела, по сравнению с более крупными животными, тепловая поддержка имеет особое значение для успешного восстановления грызунов.
5. Когда работает животное полностью проснулся, передавать Iт для дальнейшего выздоровления полностью оборудованная новой клетке мыши. Не кладите животное обратно к своей старой клетке или группе мышей. Убедитесь, что клетка, как чистая и стерильная, как можно предотвратить раневой инфекции. Контролировать весь процесс восстановления. Для передачи мышь обратно в учреждение по уходу за животными, подождите, пока он полностью восстановился и, кажется, ведут себя нормально.
   Примечание: Дополнительная пер- и послеоперационные стратегии обсуждаются Pritchett-Corning KR соавт ^6.

Результаты

Экспериментальная установка для выполнения микроинъекции и электропорации мыши яичка в естественных условиях, как он используется в соответствии с протоколом показано на рисунке 1. Несмотря на то, что можно получить изготовлены промышленным микропипетки, мы предпочита?...

Обсуждение

Исследования в области репродуктивной биологии, особенно в области мужской фертильности и сперматогенеза неизбежно опирается на живые организмы. Для того чтобы исследовать функцию яичек, никакой адекватной культуры клеток системы / в пробирке не установлено способны о?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Sigma	1-15 PK
Spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Micropipette puller	Narishige	PC-10	vertical capillary puller
Microinjection capillaries	Clark	GC100-10	borosilicate standard wall
Micropipette beveler	Bachofer	Typ 462	rotating disk beveler
Electroporator	Nepagene	CUY 21EDIT	square wave electroporator
Tweezer electrodes	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø disk electrodes
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
Cold light source	Zeiss	KL 1500LCD
Microinjection pump	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulator	homemade		XYZ cross table
Surgical instruments	FST		scissors, forceps, needle holder
Fine forceps	FST	Dumont #5, #7	efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler	FST	Michel, 12029-12
Michel suture clips	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
Surgical suture	Catgut, Markneukirchen, Germany	Catgut 00
Syringe with 30 G needle	B. Braun	Omnican 40	to load micropipette and for anesthesia
Plasmid isolation kit	Promega	Cat. # A2495	plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye	Sigma	F7258-25G	for dilution in ddH2O
10% Ketamine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Urotamin	mix in a rate 1:1 with xylazine
2% Xylazine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Xylazin	mix in a rate 1:1 with ketamine
Sterilium	Bode Chemie	Sterillium	disinfection
Vet ointment	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	opthalmic ointment to prevent eye dryness
To-Pro-3 iodide	Invitrogen	T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl	Carl Roth	3957.1
Ibuprofen, Dolormin	Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany	01094902	analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief
27 mM KCl	Carl Roth	6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O	Carl Roth	T106.2
18 mM KH2PO4	Carl Roth	3904.1