In Vivo Microiniezione e Elettroporazione di mouse Testicolo

Riepilogo

Questo articolo descrive microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo come una tecnica di trasfezione per le cellule testicolari di topo per studiare processi unici di spermatogenesi. Il protocollo presentato prevede fasi di preparazione capillare di vetro, microiniezione attraverso il dotto efferente, e trasfezione mediante elettroporazione.

Abstract

Questo contributo video e articolo fornisce una descrizione completa di microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo. Questa particolare tecnica di trasfezione di cellule testicolari del mouse permette lo studio di processi unici in spermatogenesi.

Il seguente protocollo si concentra sulla trasfezione delle cellule testicolari del mouse con costrutti plasmidici. In particolare, abbiamo utilizzato il vettore giornalista pEGFP-C1, che esprime la proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) e anche il vettore pDsRed2-N1 che esprimono la proteina fluorescente rossa (DsRed2). Entrambi i geni reporter codificati erano sotto il controllo del promotore del citomegalovirus umano immediato-precoce (CMV).

Per eseguire il trasferimento genico in testicoli di topo, i costrutti reporter di plasmide vengono iniettate in testicoli di topi viventi. A tal fine, il testicolo di un animale anestetizzato è esposto e il sito di microiniezione è preparato. Il nostro posto preferito diiniezione è il condotto efferente, con la rete testis in ultima analisi, collegato come via di trasporto anatomica degli spermatozoi tra il testicolo e dell'epididimo. In questo modo, il riempimento dei tubuli seminiferi dopo microiniezione è ottimamente gestito e controllato grazie all'utilizzo di soluzioni di DNA macchiati. Dopo aver osservato un ripieno sufficiente del testicolo dalla sua struttura tubulo colorata, l'organo è elettroporata. Questo consente il trasferimento della soluzione di DNA in cellule testicolari. Dopo 3 giorni di incubazione, il testicolo viene rimosso ed esaminato al microscopio per fluorescenza verde o rosso, illustrando il successo trasfezione.

Generalmente, questo protocollo può essere impiegato per la consegna DNA o RNA-costruisce in soggiorno topo testicolo per (sopra) esprimere o abbattere i geni, facilitando l'analisi della funzione genica in vivo. Inoltre, è adatto per studiare costrutti reporter o putativo regula geneElementi Tory. Così, i principali vantaggi della tecnica di elettroporazione sono prestazioni veloci in combinazione con il minimo sforzo, così come le attrezzature tecniche moderato e le competenze necessarie rispetto alle tecniche alternative.

Introduzione

Spermatogenesi dei mammiferi è considerato un sofisticato processo di cellule staminali di auto-rinnovamento successivamente sottoposti a mitosi, meiosi e la differenziazione al fine di sviluppare in maturo spermatozoi aploidi. Questi cambiamenti morfologici sono orchestrati da diversi tipi di cellule e nonostante i profondi tentativi, è ancora impossibile imitare questi processi in coltura cellulare ^1,2. Quindi, la ricerca sulla spermatogenesi fino ad ora si affida a organismi viventi come modelli in vivo. In generale, gli studi di funzione genica si basano generalmente su animali transgenici. Tuttavia, generare e sostenere questo tipo di modello animale è in termini di tempo, costi-intensive e molto elaborata. Questo è attribuito al processo di allevamento lungo necessario per generare e mantenere il transgene nel corso delle generazioni. Inoltre, la manipolazione genetica di tutto l'organismo dall'approccio transgenici o knockout è incline a causare alterazioni fisiologiche quando il targeting gEnes con funzioni essenziali in più regioni, ad esempio, al di fuori del testicolo o sistemica.

Inoltre, alcuni metodi di trasfezione transiente sono associati con alcuni svantaggi cruciali. Ad esempio, inconvenienti tipici di trasferimento genico virus-mediata sono la possibile provocazione di immunoreazioni e dei regolamenti di sicurezza supplementari, mentre lipofezione ³ e ⁴ microparticelle bombardamento potrebbe danneggiare il tessuto e sono limitate a una certa profondità cella di una sufficiente efficienza di trasfezione.

In contrasto, elettroporazione (EP) come un altro modo comune di trasfezione transiente, sembra costituire una tecnica promettente per consentire a trasfezione vivo e vivo analisi del gene coerente. In generale, EP viene indicato come un fenomeno dinamico che dipende dalla tensione transmembrana locale con pori di conseguenza mediate all'interno nanosecondi. Queste lacune possono essere mantenuti per i millisecondi, sufficienti to concedere l'accesso al DNA, RNA o piccole molecole ^5. Quando la tensione applicata è troppo alta, il carattere di solito transitoria di EP è contrastata a causa della produzione di calore e di induzione di permeabilizzazione troppo globale con conseguente danno irreversibile della cellula ^5.

Qui mostriamo che elettroporazione è un sistema trasfezione efficace ed economico che possa essere utilizzato per la trasformazione genetica testicolo per chiarire caratteristiche genetiche testicolari in vivo. Questo articolo affronta la preparazione plasmide, microiniezione attraverso il dotto efferente e la successiva elettroporazione del mouse del testicolo. Questa procedura può essere il mezzo di scelta per raggiungere velocemente, specifico ed efficiente trasfezione dei tubuli seminiferi del testicolo topo in vivo al fine di indagare i processi di spermatogenesi.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati sono stati approvati dal comitato etico locale (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Germania).

1 plasmidi Preparazione

1. Per la preparazione plasmide, utilizzare i kit di purificazione del plasmide (vedi tabella materiali) o metodi simili con buffer di rimozione di endotossine in modo che le reazioni immunitarie dell'animale possono essere evitati. Seguire le istruzioni del manuale. Impiegare DDH ₂ O per diluire la soluzione plasmide.
2. Eliminare i detriti facendo girare la soluzione di DNA alla massima velocità (20.000 xg). Poi raccogliere il surnatante.
3. Determinare la concentrazione plasmide con uno spettrofotometro (vedi materiali).
4. Regolare la concentrazione plasmide con DDH ₂ O a 1-3 mg (DNA) / ml. Nota: le concentrazioni più basse riducono l'efficienza di trasfezione, mentre concentrazioni più elevate possono provocare una soluzione iniettabile troppo viscoso. Inoltre, l'efficienza di trasfezione dipende dalle dimensioni del plasmide e deve essere testato singolarmente.
5. Prima dell'iniezione preparare una miscela della soluzione con ad esempio 40 microlitri plasmide con 5 ml di PBS (10x) e 5 microlitri Verde veloce (0,5%). Veloce verde è necessaria per il monitoraggio del processo di iniezione. Preferibilmente, utilizzare parete PCR-tubi sottili o Parafilm. Nota: a seconda delle dimensioni del testicolo, sarà necessario un volume di 20-50 ml per ogni testicolo.

2 Preparazione di microiniezione pipetta

1. Utilizzare capillari borosilicato (vedi tabella materiali) per la preparazione dei pipette microiniezione.
2. Tirare capillari di vetro con un capillare estrattore verticale (vedi tabella Materials).
3. Rompere la punta capillare con una pinza da dolcemente banding. La punta è di solito 50-80 micron di diametro e lunghezza di circa 1 cm. Cercate di evitare punte troppo lungo in quanto questi non sono sufficientemente rigido per penetrare il tessuto.
4. Infine, shaRPEN la punta di un 30 ° a 45 ° utilizzando un beveler micropipetta (vedi tabella Materials).
5. Caricare la pipetta microiniezione con il mix di soluzione iniettabile (vedere plasmidi Preparazione). Applicare la soluzione nel retro del capillare di vetro con una piccola siringa. Nota: Cercate di evitare bolle d'aria durante il caricamento, altrimenti questi saranno iniettati nei tubuli seminiferi con la soluzione di plasmide e quindi ridurre la conducibilità, nonché, eventualmente, causare danni ai tessuti.

3 Anestesia e Chirurgia

1. Eseguire l'operazione in condizioni asettiche, utilizzando materiale sterile (ad esempio, siringa, ago, strumenti chirurgici, ecc). Ciò consentirà di ridurre le infezioni degli animali e garantire buoni tassi di sopravvivenza.
2. Utilizzare topi maschi di elettroporazione ad un'età di 6-8 settimane.
3. Per inizializzare il trattamento analgesico post-chirurgica, forniscono il mouse con analgesici aggiunto l'acqua potabile, il giorno prima dell'intervento. Questo culoUres una analgesia preventiva in caso di altamente probabile hypodipsia post-chirurgica (assunzione di acqua diminuita). A tal fine, esporre acqua potabile con ad esempio una sospensione ibuprofene pediatrico (20 mg / ml). L'acqua da bere medicata deve essere fornito anche il primo giorno e due di recupero in concentrazione identici. Ciò significa che una dose giornaliera di 7,5 mg / kg, valida per 5 ml / acqua potabile d e peso corporeo di 25 g per 8 settimane di età C57BL / 6J. Questo regime analgesico garantisce un sollievo dal dolore fondamentale e recupero accelerato con alto benessere ^26.
4. Per preparare l'anestesia soluzione sul giorno dell'intervento di lavoro, miscelare il 10% e il 2% Ketamin Xylazin in un rapporto 1: 1 (vedi tabella Materials).
5. Per anestetizzare l'animale, diffusa 0,25 ml / 100 mg di peso corporeo di anestetico per via sottocutanea soluzione (Ketamin = 0,125 g / kg; Xylazin = 0,025 g / kg). Utilizzare un sito di iniezione tra bacino e degli arti, al fine di evitare danni d'organo e lesioni dei topi. Di solito, 10 min sono necessarifino a quando il mouse è profondamente anestetizzati.
6. Coprire gli occhi del mouse con vet pomata per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
7. Prova profonda arresto anestetico, che è evidente da una totale mancanza di risposta. A tal fine, basta pizzicare la punta dell'animale.
8. Per avviare l'operazione, rimuovere i capelli addominale con un rasoio elettrico o simile e disinfettare la zona funzionamento con sterilium o simili.
9. Fare una incisione ventrale direttamente sopra le ghiandole prepuziale nel centro della zona addominale. In quel luogo, prima tirare la pelle fuori e condurre un piccolo taglio trasversale cutanea di circa 8-14 mm. Quindi, proseguire lungo lo strato muscolare addominale.
   Nota: La lesione deve essere il più piccolo possibile per ridurre i danni all'animale.
10. Sollevare i cuscinetti di grasso addominale con attenzione per esporre il testicolo collegato e posizionarlo su una precedente preparato impermeabile usa e getta di carta drappo proprio accanto al sito di incisione (Figura 2A).
11. Utilizzare un binocolo per find il condotto efferente come destinazione di iniezione. Il dotto efferente è identificato come la multa di giunzione nave tra il testicolo e dell'epididimo. Si trova adiacente alla arteria testicolare prominente. Il dotto corre quasi con un angolo di 45 ° verso l'arteria e visibilmente entra nel epididymidis caput. Nota: A seconda dell'età del mouse, il dotto è di solito sepolto nel tessuto adiposo.
12. Utilizzare una pinza sottile per cancellare il canale efferente di questo tessuto adiposo. Dopo di che, posizionare il dotto rilasciato su una striscia di carta sterile per garantire la chiara visibilità del condotto senza compromettere dintorni.

4. Microiniezione e applicazioni del DNA

1. Collegare la pipetta microiniezione, che viene caricato con la soluzione plasmide all'unità micromanipolatore / iniettore.
2. Inserire la microiniezione ago parallelo al condotto efferente con la punta verso rete testis (Figura 2B).
3. Utilizzare pinzette sottili etogliere il condotto sopra la pipetta microiniezione. Assicurarsi che il capillare è mantenuta parallela al condotto mentre si tira su.
   Nota: Questa procedura è più conveniente che penetra la nave spostando l'ago con il micromanipolatore.
4. Dirigere l'ago con attenzione verso il testicolo e fermarsi proprio come penetra la rete testis direttamente sotto la tunica albuginea (Figura 2C).
   Nota: Nel caso che travalica la rete testis, la soluzione plasmide perderà nello spazio interstiziale. Questo generalmente porta al fallimento di transfezione tubuli seminiferi.
5. Per l'iniezione della soluzione plasmide utilizzare il microinjector con le seguenti impostazioni: pi: 100 hPa, ti: 0,2 sec, e pc: 0 hPa (Figura 2D).
6. Monitorare l'intero processo di iniezione osservando testicolo stato di riempimento con l'aiuto del colore verde. Fare attenzione che il testicolo è riempito solo fino a 2/3 del suo volume con la plsoluzione asmid (Figura 2E).
   Nota: Se il volume di iniezione viene superato, il tessuto testicolare potrebbe essere danneggiato.

5. Elettroporazione di Testicolo

1. Per abilitare elettroporazione efficace, immergere gli elettrodi pinzetta in PBS (1x). Questo assicura un adeguato conduttanza.
2. Uniformemente spremere il testicolo tra gli elettrodi bagnati (Figura 2F). Misurare la resistenza elettrica con il elettroporatore.
3. Applicare corrente al testicolo. Eseguire otto impulsi quadrati di 40 V a 4 diversi siti testicolo con una durata costante di tempo di impulso 50 msec e 950 msec intervallo di tempo.

6. ferita chiusura e post-operatorio

1. Quando elettroporazione è finito, posizionare il testicolo torna nella posizione originale.
2. Cucire lo strato muscolare interno con sutura chirurgica (vedi materiali).
3. Chiudere la pelle utilizzando spezzoni di sutura (vedi tabella materiali). Tirare la pelle fino with pinzette. Assicurati di escludere lo strato muscolare. Posizionare le clips, ciascuno ad una distanza di non più di 5 mm.
   Nota: Poiché sutura chirurgica può essere inghiottito dal mouse, clip di sutura sono favoriti per la chiusura della lesione cutanea.
4. Lasciare il mouse per recuperare da anestesia su carta assorbente sterili collocati in una gabbia sterile topo vuoto, che è temperato su un 37 ° C pad caldo. Il tampone dovrebbe garantire il riscaldamento di una metà della gabbia creando un gradiente termico. Per l'animale questo rende possibile effettuare la ricerca per la singola area, più comodo per la varietà temperatura nella gabbia. Inoltre, coprire il mouse con un foglio di carta assorbente sterile in modo che lo stress può essere ulteriormente ridotto. Nota: Dal momento che la superficie del corpo del mouse è insolitamente alta in relazione alla massa corporea, se confrontato con gli animali più grandi, il supporto termico è di particolare importanza per il successo il recupero dei roditori.
5. Quando l'animale operato si è completamente risvegliato, trasferire it per un ulteriore recupero di una nuova gabbia del mouse completamente attrezzata. Non mettere l'animale torna alla sua vecchia gabbia o ad un gruppo di topi. Assicurarsi che la gabbia è pulita e sterile possibile per prevenire l'infezione della ferita. Monitorare l'intero processo di recupero. Per trasferire il mouse torna alla struttura di cura degli animali, attendere fino a che non ha pienamente recuperato e sembra comportarsi normalmente.
   Nota: persona aggiuntiva e strategie post-chirurgici sono discusse da Pritchett-Corning KR et al ^6.

Risultati

L'impostazione sperimentale per l'esecuzione di microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo in quanto è utilizzato in base al protocollo è illustrato in Figura 1. Anche se è possibile acquisire micropipette industrialmente, abbiamo preferito di generare le nostre pipette tirando (Figura 1A ) e smussatura (Figura 1B) capillari di vetro in modo che essi montati nostre esigenze. L'attrezzatura per microiniezione ed elettroporazione ...

Discussione

La ricerca nel campo della biologia riproduttiva, in particolare nel settore della fertilità maschile e la spermatogenesi inevitabilmente si basa su organismi viventi. Al fine di esaminare la funzione testicolare, no / sistema di coltura cellulare adeguata in vitro è stata stabilita in grado di riflettere tutti i cambiamenti morfologici cruciali da un spermatogonio diploide ad aploide un maturo ^1,2 spermatozoo. Così, la generazione di animali geneticamente modificati è spesso nec...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Sigma	1-15 PK
Spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Micropipette puller	Narishige	PC-10	vertical capillary puller
Microinjection capillaries	Clark	GC100-10	borosilicate standard wall
Micropipette beveler	Bachofer	Typ 462	rotating disk beveler
Electroporator	Nepagene	CUY 21EDIT	square wave electroporator
Tweezer electrodes	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø disk electrodes
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
Cold light source	Zeiss	KL 1500LCD
Microinjection pump	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulator	homemade		XYZ cross table
Surgical instruments	FST		scissors, forceps, needle holder
Fine forceps	FST	Dumont #5, #7	efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler	FST	Michel, 12029-12
Michel suture clips	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
Surgical suture	Catgut, Markneukirchen, Germany	Catgut 00
Syringe with 30 G needle	B. Braun	Omnican 40	to load micropipette and for anesthesia
Plasmid isolation kit	Promega	Cat. # A2495	plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye	Sigma	F7258-25G	for dilution in ddH2O
10% Ketamine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Urotamin	mix in a rate 1:1 with xylazine
2% Xylazine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Xylazin	mix in a rate 1:1 with ketamine
Sterilium	Bode Chemie	Sterillium	disinfection
Vet ointment	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	opthalmic ointment to prevent eye dryness
To-Pro-3 iodide	Invitrogen	T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl	Carl Roth	3957.1
Ibuprofen, Dolormin	Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany	01094902	analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief
27 mM KCl	Carl Roth	6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O	Carl Roth	T106.2
18 mM KH2PO4	Carl Roth	3904.1