Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

Özet

Testis fare hücreleri için bir transfeksiyon tekniği Spermatogenezisin benzersiz süreçleri incelemek için bu makalede, in vivo mikroenjeksiyon ve fare testis Elektroporasvon açıklar. Sunulan protokol, elektroporasyon ile cam kılcal hazırlanması götürücü kanalı yoluyla mikro-enjeksiyon, ve transfeksiyon adımlar içerir.

Özet

Bu video ve makale katkı mikroenjeksiyon ve in vivo fare testis elektroporasyon kapsamlı bir açıklamasını verir. Testis fare hücreleri için bu özel teknik transfeksiyon spermatogenez benzersiz süreçlerin çalışma sağlar.

Aşağıdaki protokol, plazmid yapıları ile fare testis hücrelerin transfeksiyonu odaklanmaktadır. Özellikle, kırmızı flöresanlı proteinin (DsRed2) ifade yeşil flüoresan protein (EGFP) ve ayrıca pDsRed2-N1 vektör geliştirilmiş ifade eden raportör vektör pEGFP-C1, ikinci. Her iki raportör genler kodlanan insan sitomegalovirüs hemen erken promoteri (CMV) kontrolü altındaydı.

Fare testislerinde gen transferini gerçekleştirmek için, raportör plasmid yapıları, canlı farelerde testis enjekte edilir. Bu amaçla, bir hayvan anestetize testis maruz kalmakta ve mikroenjeksiyon site hazırlanır. Bizim tercih yerienjeksiyon testis ve epididim arasında spermlerin anatomik taşıma rotası olarak sonuçta bağlı rete testis ile, efferent kanal olduğunu. Bu şekilde, mikro enjeksiyon sonrası seminifer tüp doldurma sayesinde mükemmel lekeli DNA çözeltilerinin kullanılması ile idare ve kontrol edilir. Onun renkli tübül yapısı ile testisin yeterli dolgu gözlemledikten sonra, organ elektropore edilmiştir. Bu testis hücrelere DNA solüsyonu aktarılmasını sağlar. Inkübasyon 3 gün sonra, testis çıkarılır ve transfeksiyon başarı gösteren, yeşil ve kırmızı floresans mikroskobu altında incelendi.

Genellikle, bu protokol DNA- ya RNA- teslim için kullanılabilir için canlı fare testisi içine inşa (over) ifade veya in vivo gen fonksiyon analizinde kolaylaştırılması, genleri yıkmak. Ayrıca, raportör gen ya da putatif düzenlenmesinden çalışmak için uygundurTory elemanları. Böylece, elektroporasyon tekniğinin ana avantajları, alternatif tekniklerle karşılaştırıldığında Gerekli düşük çaba yanı sıra ılımlı teknik ekipman ve becerileri ile birlikte hızlı performans vardır.

Giriş

Memeli spermatogenez olgun haploid sperm içine geliştirmek amacıyla art arda mitoz, mayoz ve farklılaşma geçiren kendini yenileyen kök hücrelerin karmaşık bir süreç olarak kabul edilir. Bu morfolojik değişiklikler, farklı hücre tipleri tarafından orkestra ve derin girişimlerine rağmen, hücre kültürü ^1,2 bu süreçleri taklit hala imkansız. Dolayısıyla, bugüne kadar spermatogenez üzerine araştırmalar in vivo model olarak yaşayan organizmalar dayanır. Genel olarak, gen fonksiyonu çalışmalar, genellikle transgenik hayvanlarda dayanmaktadır. Bununla birlikte, üretme ve hayvan modellerinde bu tür sürdürülmesi zaman alıcı ve maliyet-yoğun ve oldukça karmaşıktır. Bu üreten ve nesiller boyunca transgen korumak için gerekli uzun yetiştirme süreci atfedilir. Buna ek olarak, transgenik ya da nakavt yaklaşım bütün organizmanın genetik manipülasyon g hedeflerken fizyolojik bozulmalara neden eğilimliÖrneğin birden fazla bölgelerde, temel işlevleri, testis dışında veya sistemik ile enes.

Bundan başka, bazı geçiş transfeksiyon yöntemleri bazı önemli dezavantajlar ile ilişkilidir. Lipofeksiyon ³ ve mikro-parçacık bombardımanı ⁴ dokuya zarar verebilir ve yeterli transfeksiyon verimi açısından belirli bir hücre derinliği ile sınırlıdır, oysa Örneğin, virüs aracılı gen transferi tipik dezavantajları, immün reaksiyonlar ve ilave güvenlik düzenlemelerinin olası provokasyon bulunmaktadır.

Buna karşılık, geçici nakiller başka bir ortak yolu olarak elektroporasyon (AP), in vivo nakil ve tutarlı in vivo gen analizi etkinleştirmek için umut verici bir teknik teşkil görünüyor. Genel olarak, AP nanosaniye olan sonuç olarak aracılı gözenek ile yerel zar gerilimine bağlı olarak dinamik bir olgu olarak adlandırılır. Bu boşluklar milisaniye boyunca muhafaza edilebilir, yeterli To DNA, RNA veya küçük moleküllerin ⁵ erişim izni. Uygulanan gerilim çok yüksek olduğunda, EP genellikle geçici karakteri nedeniyle ısı üretimi ve hücre ⁵ sonuçta geri dönüşümsüz hasar ile çok kapsamlı geçirgenleştirmeden indüksiyonu ile karşılaşmaktadır.

Burada, elektroporasyon in vivo gen testis özelliklerinin ortaya konması için genetik dönüşümü için uygulanan testis olma yeteneğine sahip bir etkin ve ekonomik bir transfeksiyon sistemi olduğunu göstermektedir. Bu makalede, götürücü kanal ve fare testis sonra elektroporasyon ile bir plazmid hazırlama işlemi, mikro-enjeksiyon giderir. Bu prosedür, spermatogenez işlemlerini incelemek için in vivo fare testis seminifer tüp hızlı, spesifik ve verimli transfeksiyona elde etmek için tercih edilen bir araç olabilir.

Protokol

Tüm yapılan hayvan deneyleri yerel etik kurul (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Almanya) tarafından onaylanmıştır.

1. Plazmid Preparasyon

1. Plazmid hazırlanması için, plazmid arıtma kitleri (Malzemeler tabloya bakınız) ya da hayvanın bağışıklık reaksiyonları önlenebilir ve böylece endotoksin çıkartma tampon maddesi ile benzer bir yöntem kullanınız. Kılavuzun yönergeleri izleyin. Plasmid dilüsyon için GKD ₂ O kullanır.
2. Maksimum hızda (20.000 xg) DNA çözüm iplik artıkları ortadan kaldırın. Daha sonra süpernatan toplamak.
3. Bir spektrofotometre (materyalleri görmek) ile plazmid konsantrasyonunu belirleyin.
4. 1-3 mikrogram (DNA) / ul GKD ₂ O ile plazmid konsantrasyon ayarlayın. Not: Daha yüksek konsantrasyonlar çok viskoz enjeksiyon çözüm neden olabilir iken düşük konsantrasyonlar, transfeksiyon etkinliğini azaltacaktır. Bunun yanı sıra,transfeksiyon verimi plazmidin büyüklüğüne bağlıdır ve ayrı ayrı test edilmesi gerekir.
5. Enjeksiyondan önce, bir çözelti, karışımı hazırlamak 5 ul PBS (10x) ve 5 ul Fast Green (% 0.5) ile birlikte, örneğin 40 ul plasmid için. Hızlı Yeşil enjeksiyon işlemi takip için gereklidir. Tercihen, ince duvarlı PCR-tüpleri veya Parafilm kullanın. Not: Testis büyüklüğüne bağlı olarak, 20-50 ul'lik bir hacim testisler için gerekli olacaktır.

Mikroenjeksiyon Pipet 2. hazırlanması

1. Mikroenjeksiyon pipetler hazırlanması için borosilikat kılcal damarları (Malzemeler tabloya bakınız) kullanın.
2. Dikey kılcal çektirmesi ile cam kılcal damarları çekin (Malzemeler tabloya bakınız).
3. Usulca bantlama forseps ile kılcal ucunu kırmak. Ucu genellikle 50-80 mm çapında ve yaklaşık 1 cm uzunluğundadır. Bu dokuya nüfuz kadar sert değildir gibi çok uzun ipuçlarını kaçının.
4. Son, sha atBir mikropipet beveler (Malzemeler tabloya bakınız) kullanılarak 45 ° açı 30 derece ucu rpen.
5. Enjeksiyon solüsyon karışımı ile mikroenjeksiyon pipet yükleyin (plazmid Hazırlama bakınız). Küçük bir şırınga ile cam kılcal arkasına çözümü uygulayın. Not: iletkenliği azaltmak hem de muhtemelen doku hasarına neden olur böylece, aksi takdirde, bu çözelti ile birlikte plazmid seminifer tüp içine enjekte edilecektir, yükleme sırasında, hava kabarcıklarını önlemek için deneyin.

3. Anestezi ve Cerrahi

1. Steril (yani, şırınga, iğne, cerrahi aletler, vb) malzeme kullanılarak aseptik koşullarda işlemi gerçekleştirin. Bu hayvanın enfeksiyonu azaltmak ve iyi sağkalım oranları sağlayacaktır.
2. 6-8 haftalık bir yaşta elektroporasyon için erkek fareler kullanın.
3. Cerrahi sonrası analjezik tedavi başlatmak için, analjezikler ile fare ameliyattan önce günde içme suyu eklendi sağlar. Bu götkuvvetle muhtemel cerrahi sonrası hypodipsia (azaltılmış su emme) durumunda önleyici bir analjezi etmiş olur. Bu amaçla, örneğin, bir çocuk, ibuprofen süspansiyonu (20 mg / ml) ile içme suyu maruz kalmaktadır. İlaçlı içme suyu da günde bir ve aynı konsantrasyonda iyileşme iki temin edilmelidir. Bu C57BL / 6J yaş 8 hafta boyunca 25 g, 5 ml / g içme suyu ve vücut ağırlığı için geçerli bir 7.5 mg / kg arasında günlük bir doz anlamına gelir. Bu analjezik rejimi temel bir ağrı ve yüksek refah ²⁶ ile birlikte hızlandırılmış kurtarma garanti.
4. (Malzemeler tabloya bakınız): 1 oranında cerrahi gününde çalışma çözeltisi anestezi hazırlanması için, 1% 10 Ketamin ve% 2 ksilazin karıştırın.
5. Anestezi sıvısı deri altından 0.25 ml 100 mg / vücut ağırlığı tatbik ediniz, hayvan anestetize için (Ketamin = 0.125 g / kg, ksilazin = 0.025 g / kg). Farelerin organ hasarı ve yaralanmaları önlemek için pelvik ve ekstremite arasında bir enjeksiyon sitesini kullanın. Genellikle, 10 dakika ihtiyaç vardırkadar fare derin anestezi.
6. Anestezi sırasında kuruluğunu önlemek için veteriner merhem ile fare gözleri örtün.
7. Yanıt toplam eksikliği tarafından fark edilir derin anestezi tutuklama, sınayın. Bu amaçla, sadece hayvan ayak tutturulur.
8. Ameliyat başlatmak için, bir elektrikli tıraş makinesi veya benzeri ile karın tüylerini ve STERILIUM veya benzeri ile çalışma alanı dezenfekte.
9. Doğrudan karın bölgesinin merkezinde Sünnet bezlerinin üstünde bir ventral kesi yapmak. O yerde, ilk deplasman cilt çekin ve yaklaşık 8-14 mm'lik küçük enine deri kesim yapmak. Daha sonra, abdominal kas tabakası boyunca devam eder.
   Not: hayvana zarar azaltılması için mümkün olduğunca lezyon kadar küçük olmalıdır.
10. Ekli testis ortaya çıkarmak ve sadece kesi yerinde (Şekil 2A) yanında bir önceki hazırlanmış su geçirmez tek kullanımlık kağıt örtü üzerine yerleştirmek için dikkatle karın yağ yastıkları yukarı çekin.
11. F dürbün kullanınenjeksiyon hedef olarak götürücü kanalını ind. Duktus efferent testis ve epididimis arasındaki ince damar kavşak olarak tanımlanır. Bu önemli testis arter bitişiğinde yer almaktadır. Duktus arter 45 ° 'lik bir açıyla neredeyse çalışır ve gözle kaput epididimisdeki girer. Not: fare yaşına bağlı olarak, duktus genellikle yağ dokusunda gömüldü.
12. Bu yağ dokusu efferent kanalını temizlemek için ince forseps kullanın. Daha sonra, çevre bozmadan kanalının net bir görüş sağlamak için steril kağıt şerit üzerinde serbest duktus yerleştirin.

4. Mikroenjeksiyon ve DNA Uygulaması

1. Mikromanipülatör / enjektör ünitesine plazmid çözüm ile yüklenir mikroenjeksiyon pipet, bağlayın.
2. Ucu rete testis (Şekil 2B) bakacak olan götürücü kanala mikroenjeksiyon iğne paralel yerleştirin.
3. Ince cımbız kullanın vemikroenjeksiyon pipet kanalı üzerinde şerit. Bunu üzerine çekerken kılcal kanala paralel tutulur emin olun.
   Not: Bu yordam mikromanipülatör ile iğne hareket ettirerek gemiyi nüfuz daha uygundur.
4. Testis doğru dikkatlice iğneyi yönlendirmek ve bu tunika albuginea (Şekil 2C) altında direkt rete testisi nüfuz olarak sadece durdurmak.
   Not: retenin testis overreaching durumunda, plazmit çözelti ara boşluk içine akar. Bu genellikle seminifer tübüller transfecting yetmezliğine yol açar.
5. Pi: 100 hPa, ti: 0.2 sn, ve pc: 0 hPa (Şekil 2B) plazmid çözüm enjeksiyon için aşağıdaki ayarları ile mikropüskürtücüden kullanmaktadır.
6. Yeşil renk yardımıyla durumunu doldurma testisi gözlemleyerek tüm enjeksiyon sürecini izlemek. Testis sadece pl ile hacmine 2/3 kadar dolu olduğunu özenasmid çözeltisi (Şekil 2E).
   Not: enjeksiyon hacmi aşılırsa, testis dokusu zarar görebilir.

Testis 5. Elektroporasyon

1. Etkili elektroporasyon etkinleştirmek PBS (1x) olarak cımbız elektrotlar emmek için. Bu, yeterli iletkenlik sağlar.
2. Sorunsuz ıslak elektrotlar (Şekil 2F) arasındaki testis sıkmak. Elektroporatörü ile elektrik direncini ölçün.
3. Testis akım uygulayın. 50 msn darbe süresi ve 950 ms aralığı sabit bir zaman süresi ile 4 farklı testis sitelerinde 40 V sekiz kare darbeleri uygulayın.

6. Yara Kapatma ve Post-cerrahi

1. Elektroporasyon bittiğinde, geri özgün konumunda testis yerleştirin.
2. Cerrahi sütür (materyalleri görmek) ile iç kas tabakası diker.
3. Sütür klipleri (Malzemeler tabloya bakınız) kullanılarak cilt kapatın. Cildi zekâ çekinh cımbız. Kas tabakası dışlamak emin olun. En fazla 5 mm mesafede klipsleri, her bir koyun.
   Not: cerrahi dikiş fare tarafından yutulabilir Çünkü, sütür klipler cilt lezyonu kapatılması için tercih edilir.
4. Fare 37 ° C sıcak pad üzerinde temperli steril boş fare kafes içinde yerleştirilen steril kağıt havlu üzerinde anestezi kurtarmak için izin verin. Ped, bir ısı derecesi oluşturarak kafesin yarısının ısınma sağlamalıdır. Hayvan için bu durum kafeste sıcaklık çeşitli bireysel, en rahat alanı aramak için mümkün kılar. Ek olarak, stres daha da azaltılabilir, böylece steril kağıt havlu tabakası ile fare kapsamaktadır. Not: fare vücut yüzeyi vücut kütlesi ile ilgili olarak olağanüstü yüksek olması nedeniyle daha büyük hayvanlar ile karşılaştırıldığında, termal destek kemirgen başarılı bir şekilde geri kazanılması için özel bir önem taşımaktadır.
5. Işletilen hayvan tamamen uyanmış zaman, i aktarmaktam donanımlı bir yeni fare kafesine daha kurtarma için t. Eski kafes ya da bir grup farenin geri hayvan koyma. Kafes yara enfeksiyonu önlemek için mümkün olduğunca temiz ve steril olduğundan emin olun. Tüm kurtarma sürecini izlemek. Tamamen iyileşti ve normal davranmaya görünüyor kadar geri hayvan bakım tesisi için fareyi aktarmak için, bekle.
   Not: Ek per- ve ameliyat sonrası stratejiler Pritchett-Coming KR ve ark ⁶ tarafından tartışılmıştır.

Sonuçlar

Kullanıldığı olarak in vivo fare testis mikro-enjeksiyon ve elektroporasyon gerçekleştirmek için protokole uygun olarak, deneysel ortamda, sınai olarak imal edilmiş mikropipetler elde etmek mümkün olsa da. Şekil 1 'de gösterilmiş olduğu için, (Şekil 1A çekerek kendi pipetler oluşturmak için tercih edilen bir böylece) ve bizote (Şekil 1B) cam kapilerleri onlar bizim ihtiyaçlarını donatılmış. Mikro enjeksiyon ve elektroporasyon iç...

Tartışmalar

Özellikle erkek infertilitesi ve kaçınılmaz spermatogenez alanında üreme biyolojisi alanında, araştırma canlı organizmalar üzerinde dayanır. Testis işlevini incelemek amacıyla, yeterli hücre kültürü / in vitro bir sistem haploid olgun sperm ^1,2 diploid spermatogonyum tüm önemli morfolojik değişiklikler yansıtma kapasitesine kurulmuştur. Böylece, genetik olarak değiştirilmiş hayvanların üretimi genellikle gereklidir ve erkek üreme biyolojisi böyle değe...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Sigma	1-15 PK
Spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Micropipette puller	Narishige	PC-10	vertical capillary puller
Microinjection capillaries	Clark	GC100-10	borosilicate standard wall
Micropipette beveler	Bachofer	Typ 462	rotating disk beveler
Electroporator	Nepagene	CUY 21EDIT	square wave electroporator
Tweezer electrodes	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø disk electrodes
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
Cold light source	Zeiss	KL 1500LCD
Microinjection pump	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulator	homemade		XYZ cross table
Surgical instruments	FST		scissors, forceps, needle holder
Fine forceps	FST	Dumont #5, #7	efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler	FST	Michel, 12029-12
Michel suture clips	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
Surgical suture	Catgut, Markneukirchen, Germany	Catgut 00
Syringe with 30 G needle	B. Braun	Omnican 40	to load micropipette and for anesthesia
Plasmid isolation kit	Promega	Cat. # A2495	plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye	Sigma	F7258-25G	for dilution in ddH2O
10% Ketamine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Urotamin	mix in a rate 1:1 with xylazine
2% Xylazine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Xylazin	mix in a rate 1:1 with ketamine
Sterilium	Bode Chemie	Sterillium	disinfection
Vet ointment	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	opthalmic ointment to prevent eye dryness
To-Pro-3 iodide	Invitrogen	T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl	Carl Roth	3957.1
Ibuprofen, Dolormin	Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany	01094902	analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief
27 mM KCl	Carl Roth	6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O	Carl Roth	T106.2
18 mM KH2PO4	Carl Roth	3904.1