In Vivo microinjeção e Eletroporação de testículos de camundongo

Resumo

Este artigo descreve a microinjecção e a electroporação de testículo do rato in vivo, como uma técnica para a transfecção de células de testículo de rato para estudar os processos exclusivos da espermatogénese. O protocolo apresentado envolve os passos de preparação de capilar de vidro, através da conduta de microinjecção eferente, e transfecção por electroporação.

Resumo

Esta contribuição de vídeo e artigo apresenta uma descrição abrangente de microinjeção e eletroporação de testículo do rato in vivo. Esta técnica de transfecção particular para células testiculares de mouse permite o estudo de processos exclusivos na espermatogênese.

O protocolo a seguir concentra-se em transfecção de células de testículo de rato, com as construções de plasmídeos. Especificamente, utilizou-se o vector repórter pEGFP-C1, que expressa a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) e também o vector pDsRed2 N1-expressar a proteína fluorescente vermelha (DsRed2). Ambos os genes repórter foram codificados sob o controlo do promotor de citomegalovírus humano imediato precoce (CMV).

Para realizar a transferência de genes em testículos de rato, as construções de plasmídeos repórter são injectados em testículos de ratos vivos. Para esse efeito, o testículo de um animal anestesiado é exposta e o local de microinjecção é preparado. O nosso lugar preferido deinjeção é o ducto eferente, com a rede testicular, em última instância conectada como a rota de transporte anatômica dos espermatozóides entre o testículo e epidídimo. Desta forma, o enchimento dos túbulos seminíferos após microinjecção é excelentemente gerido e controlado, devido à utilização de soluções de ADN coradas. Depois de observar um enchimento suficiente do testículo por sua estrutura tubular de cor, o órgão é electroporado. Isto permite a transferência da solução de ADN para dentro das células dos testículos. Na sequência de 3 dias de incubação, os testículos são removidos e investigada sob o microscópio de fluorescência verde ou vermelho, ilustrando o sucesso da transfecção.

Geralmente, este protocolo pode ser utilizado para a entrega de DNA- ou RNA- constrói na vida do mouse testis, a fim de (mais) expressar ou derrubar genes, facilitando na análise da função dos genes vivo. Além disso, é adequado para o estudo de construções repórter ou regula gene putativoelementos Conservador. Assim, as principais vantagens da técnica de eletroporação é rápido desempenho em combinação com baixo esforço, bem como o equipamento técnico moderado e as habilidades necessárias em relação a técnicas alternativas.

Introdução

Espermatogénese mamíferos é considerado um processo sofisticado de células estaminais auto-renovação submetidos sucessivamente a mitose, meiose e a diferenciação, a fim de se desenvolver em espermatozóides maduros haplóide. Estas alterações morfológicas são orquestradas por diferentes tipos de células e, apesar das tentativas profundas, ainda não é possível para imitar esses processos de cultura de células de ^1,2. Portanto, as pesquisas sobre a espermatogênese até agora depende de organismos vivos como modelos in vivo. Em geral, os estudos de função gênica são geralmente baseados em animais transgênicos. No entanto, gerar e manter este tipo de modelo animal é demorado, dispendioso e muito elaborado. Isto é atribuído ao processo de criação de comprimento necessária para a geração e manutenção do transgene ao longo de gerações. Além disso, a manipulação genética de todo o organismo pela abordagem transgênicos ou knockout é propenso a causar danos fisiológicos ao direcionamento genes com funções essenciais em várias regiões, como por exemplo, fora do testículo ou sistemicamente.

Além disso, alguns métodos de transfecção transiente estão associados com alguns inconvenientes fundamentais. Por exemplo, desvantagens típicas de transferência de genes mediada por vírus são a provocação de possíveis reacções imunológicas e regulamentos de segurança adicionais, ao passo que a lipofecção ³ e ⁴ bombardeamento com micropartículas pode danificar o tecido e são limitados a uma certa profundidade da célula suficiente para a eficiência de transfecção.

Em contraste, electroporação (EP) como outra forma comum de transfecção transiente, parece constituir uma técnica promissora para permitir na transfecção in vivo e na análise de genes in vivo consistentes. Em geral, a EP é referido como um fenómeno dinâmico que depende da tensão transmembranar local com poros consequentemente mediadas dentro nanossegundos. Essas lacunas podem ser mantidos por milésimos de segundo, suficiente to conceder acesso ao DNA, RNA ou pequenas moléculas ^5. Quando a tensão aplicada for muito elevada, o carácter geralmente transiente de PE é contrariada, devido à produção de calor e de permeabilização de indução muito abrangente, com consequente dano irreversível da célula ^5.

Aqui, mostramos que a electroporação é um sistema de transfecção mais eficaz e económica, que é capaz de ser utilizado para a transformação genética do testículo, de modo a elucidar as características de genes in vivo testiculares. Este artigo aborda preparação plasmídeo, microinjeção via o ducto eferente ea eletroporação posterior de rato testículo. Este procedimento pode ser o meio de escolha para atingir a transfecção rápida, específica e eficaz de túbulos seminíferos de testículo do rato in vivo, a fim de investigar os processos de espermatogénese.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais realizados foram aprovados pelo comitê local de ética (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Pomerânia Ocidental, Alemanha).

1. plasmídeo Preparação

1. Para a preparação de plasmídeo, utilizar kits de purificação de plasmídeo (ver tabela de materiais) ou métodos semelhantes com tampão de remoção de endotoxinas de forma que as reacções imunitárias do animal podem ser evitadas. Siga as instruções do manual. Empregar _ddH2O para diluir a solução de plasmídeo.
2. Elimine os restos girando a solução de DNA em velocidade máxima (20.000 xg). Em seguida, recolher o sobrenadante.
3. Determinar a concentração de plasmídeo com um espectrofotômetro (ver materiais).
4. Ajustar a concentração de plasmídeo com _ddH2O a 1-3 ug (ADN) / uL. Nota: as concentrações mais baixas irão reduzir a eficiência de transfecção, enquanto que as concentrações mais elevadas pode causar uma solução de injecção muito viscoso. Além disso, oa eficiência de transfecção depende do tamanho do plasmídeo e tem de ser testado individualmente.
5. Antes da injecção, preparar uma mistura de solução com, por exemplo, 40 ul de plasmídeo em conjunto com 5 mL de PBS (10x) e 5 ul Verde Rápido (0,5%). Fast Green é necessária para acompanhar o processo de injeção. De preferência, use parede PCR tubos finos ou Parafilm. Nota: Dependendo do tamanho do testículo, vai ser necessário um volume de 20-50 mL de cada testículo.

2 Preparação de microinjeção Pipeta

1. Use capilares de borosilicato (ver tabela de materiais) para a preparação das pipetas de microinjeção.
2. Puxe capilares de vidro com um extrator capilar vertical (veja a tabela de materiais).
3. Quebre a ponta capilar com uma pinça por suavemente bandas. A ponta é geralmente de 50-80 fim de diâmetro e cerca de 1 cm de comprimento. Tente evitar dicas que são muito longos como estes não são rígidas o suficiente para penetrar no tecido.
4. Enfim, sharpen a ponta na 30 ° a 45 ° de ângulo usando um beveler micropipeta (veja a tabela de materiais).
5. Coloque a pipeta de microinjeção com a mistura de solução injectável (ver Preparação de plasmídeo). Aplicar a solução para o fundo do tubo capilar de vidro com uma pequena seringa. Nota: Tente evitar bolhas de ar durante o carregamento, caso contrário estes serão injetados nos túbulos seminíferos, juntamente com a solução de plasmídeo e, portanto, irá reduzir a condutividade, bem como, eventualmente, causar danos aos tecidos.

3 Anestesia e Cirurgia

1. Executar a operação sob condições assépticas, utilizando materiais estéreis (ou seja, seringa, agulha, instrumentos cirúrgicos, etc). Isto irá reduzir a infecção do animal e garantir boas taxas de sobrevivência.
2. Use camundongos machos para eletroporação em uma idade de 6-8 semanas.
3. Para inicializar o tratamento analgésico pós-cirúrgico, fornecer o mouse com analgésicos adicionado água potável no dia anterior à cirurgia. Este burroUres a analgesia preventiva em caso de hypodipsia postsurgical altamente provável (a ingestão de água diminuída). Para este fim, expor a água potável, com por exemplo uma suspensão de ibuprofeno pediátrico (20 mg / ml). A água para beber medicada também deve ser fornecida em um dia e dois de recuperação na concentração idêntica. Isto significa que uma dose diária de 7,5 mg / kg, a validade de 5 ml / d de água potável e de 25 g de peso corporal durante 8 semanas, com idade C57BL / 6J. Este regime analgésico garante um alívio da dor fundamental e recuperação acelerada junto com elevado bem-estar ^26.
4. Para a preparação da solução de anestesia no dia da cirurgia de trabalho, misturar 10% cetamina e xilazina a 2% em uma proporção de 1: 1 (ver tabela Materiais).
5. Para anestesiar o animal, aplicam-se 0,25 ml / 100 mg de peso corporal por via subcutânea da solução anestésica (cetamina = 0,125 g / kg; Xilazina = 0,025 g / kg). Utilize um local de injecção entre pélvica e nos membros, a fim de evitar danos a órgãos e lesões dos camundongos. Geralmente, são necessários 10 minaté que o mouse está profundamente anestesiados.
6. Cubra os olhos do rato com vet pomada para evitar o ressecamento durante a anestesia.
7. Teste a parada anestésico, o que é perceptível por uma total falta de resposta. Para esse efeito, basta apertar o dedo do pé do animal.
8. Para iniciar a operação, remover o cabelo abdominal com um barbeador elétrico ou similar e desinfectar a área de operação com sterilium ou similar.
9. Fazer uma incisão ventral directamente acima das glândulas prepucial no centro da área abdominal. Naquele lugar, primeiro puxe a pele longe e realizar um pequeno corte cutânea transversal de cerca de 8-14 mm. Em seguida, continuar ao longo da camada muscular abdominal.
   Nota: A lesão deve ser tão pequeno quanto possível para reduzir os efeitos nocivos para o animal.
10. Puxe para cima as bolsas de gordura abdominal cuidadosamente para expor o testículo em anexo e coloque-o em uma cortina impermeável preparado antes descartável de papel ao lado do local da incisão (Figura 2A).
11. Use binóculos para find o ducto eferente como o alvo da injeção. O eferente ductus é identificada como a junção navio tênue entre o testículo e epidídimo. Ele está localizado ao lado da artéria testicular proeminente. O canal funciona quase em um ângulo de 45 ° para a artéria e visivelmente entra no epidídimo caput. Nota: Dependendo da idade do mouse, o canal é geralmente enterrada no tecido adiposo.
12. Use uma pinça fina para limpar o ducto eferente deste tecido adiposo. Depois disso, coloque o ductus lançado em uma tira de papel estéril para assegurar a clara visibilidade do ducto sem prejudicar arredores.

4. microinjeção e Aplicação DNA

1. Ligue o pipeta microinjecção, que é carregado com a solução de plasmídeo para a unidade micromanipulador / injector.
2. Inserir a agulha de microinjecção paralelo à conduta eferente com a ponta voltada para a rede testicular (Figura 2B).
3. Use uma pinça fina etiras da conduta através da pipeta micro-injecção. Certifique-se de que o capilar é mantido paralelo ao ducto enquanto a puxa para cima.
   Nota: Este procedimento é mais conveniente do que penetrar no navio, movendo a agulha com a micromanipulador.
4. Direcione a agulha cuidadosamente para o testículo e parar assim como penetra na rete testis diretamente abaixo da túnica albugínea (Figura 2C).
   Nota: No caso de overreaching rete testis, a solução plasmídeo vai vazar para o espaço intersticial. Isso geralmente leva ao fracasso de transfecção dos túbulos seminíferos.
5. Para a injecção da solução de plasmídeo utilizar o microinjetor com seguintes configurações: pi: 100 hPa ti,: 0,2 seg, e pc: 0 hPa (Figura 2D).
6. Acompanhar todo o processo de injecção por meio da observação do estado de enchimento do testículo com a ajuda da cor verde. Tome cuidado para que o testículo só é cheio até dois terços do seu volume com o plsolução asmid (Figura 2E).
   Nota: Se o volume de injeção for excedido, o tecido testicular podem ser prejudicados.

5. Eletroporação de Testículo

1. Para habilitar eletroporação eficaz, mergulhe os eletrodos pinça em PBS (1x). Isto assegura condutância adequada.
2. Suavemente aperte o testículo entre os eletrodos molhados (Figura 2F). Meça a resistência elétrica com a electroporator.
3. Aplique corrente ao testículo. Execute oito pulsos quadrados de 40 V em 4 locais diferentes testículo com uma duração constante de 50 ms e tempo de pulso de 950 ms tempo de intervalo.

6. Wound Encerramento e Pós-cirurgia

1. Quando eletroporação estiver concluída, coloque o testículo de volta ao local original.
2. Costure a camada muscular interna com sutura cirúrgica (ver materiais).
3. Feche a pele através do emprego de grampos de sutura (ver tabela de materiais). Retire a pele para cima sagacidadeh pinças. Certifique-se de excluir a camada muscular. Coloque os clipes, cada um a uma distância de não mais de 5 mm.
   Nota: Por causa de sutura cirúrgica pode ser engolido pelo mouse, clipes de sutura são favorecidos para fechar a lesão de pele.
4. Permitir que o rato a recuperar da anestesia sobre toalhas de papel estéreis colocados numa gaiola do rato estéril vazio, que é temperado numa almofada quente 37 ° C. A almofada deve assegurar o aquecimento de um meio da gaiola criando um gradiente de calor. Para o animal torna-se possível procurar a área individual, mais confortável, devido à variedade de temperatura na gaiola. Além disso, cubra o mouse com uma folha de papel toalha estéril para que o estresse pode ser ainda mais reduzida. Nota: Como a superfície do corpo do rato é extraordinariamente alta em relação à massa corporal, quando comparados com animais de maior porte, o apoio térmica é de particular importância para a recuperação bem sucedida de roedores.
5. Quando o animal tem operado totalmente desperto, transferir it para posterior recuperação para uma nova gaiola do rato completamente equipada. Não coloque o animal de volta para sua gaiola de idade ou para um grupo de camundongos. Certifique-se que a gaiola é limpa e estéril quanto possível para prevenir a infecção da ferida. Acompanhar todo o processo de recuperação. Para transferir o mouse de volta para a unidade de cuidados animal, espere até que ele se recuperou totalmente e parece comportar-se normalmente.
   Nota: estratégias pós-cirúrgicos per- adicionais e são discutidos por Pritchett-Corning KR et al ^6.

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Resultados

A configuração experimental para a realização de micro-injecção e de electroporação de testículo do rato in vivo, uma vez que é usado de acordo com o protocolo ilustrado na Figura 1. Embora seja possível para adquirir as micropipetas de fabrico industrial, que preferido para gerar os nossos próprios pipetas puxando (Figura 1A e) chanfradura (Figura 1B) capilares de vidro para se adequarem às necessidades. O equipamento para a microinjecção e elec...

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Discussão

A investigação no campo da biologia reprodutiva, em especial na área da fertilidade masculina e, inevitavelmente, a espermatogénese depende de organismos vivos. A fim de examinar a função testicular, sem / sistema de cultura de células in vitro adequada foi estabelecida capaz de reflectir as alterações morfológicas importantes de um diplóide spermatogonium para um ^1,2 espermatozóide maduro haplóide. Assim, a geração de animais geneticamente modificados é muitas vezes ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Sigma	1-15 PK
Spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Micropipette puller	Narishige	PC-10	vertical capillary puller
Microinjection capillaries	Clark	GC100-10	borosilicate standard wall
Micropipette beveler	Bachofer	Typ 462	rotating disk beveler
Electroporator	Nepagene	CUY 21EDIT	square wave electroporator
Tweezer electrodes	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø disk electrodes
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
Cold light source	Zeiss	KL 1500LCD
Microinjection pump	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulator	homemade		XYZ cross table
Surgical instruments	FST		scissors, forceps, needle holder
Fine forceps	FST	Dumont #5, #7	efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler	FST	Michel, 12029-12
Michel suture clips	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
Surgical suture	Catgut, Markneukirchen, Germany	Catgut 00
Syringe with 30 G needle	B. Braun	Omnican 40	to load micropipette and for anesthesia
Plasmid isolation kit	Promega	Cat. # A2495	plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye	Sigma	F7258-25G	for dilution in ddH2O
10% Ketamine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Urotamin	mix in a rate 1:1 with xylazine
2% Xylazine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Xylazin	mix in a rate 1:1 with ketamine
Sterilium	Bode Chemie	Sterillium	disinfection
Vet ointment	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	opthalmic ointment to prevent eye dryness
To-Pro-3 iodide	Invitrogen	T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl	Carl Roth	3957.1
Ibuprofen, Dolormin	Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany	01094902	analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief
27 mM KCl	Carl Roth	6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O	Carl Roth	T106.2
18 mM KH2PO4	Carl Roth	3904.1