大鼠脑组织被提取物的高分辨核磁共振代谢组学分析

摘要

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

摘要

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

引言

小鼠模型已被广泛利用在大脑研究^1。基因型-表型的相关性进行了研究在小鼠和大鼠的大脑通过研究基因表达在一方面的RNA和/或蛋白水平，和形态，功能，电和/或行为的表现型上的其它^2-6。然而，为了完全理解联的表型基因型的机制，就必须进行调查的分子事件的下游蛋白的表达， 即 。生化基板在其酶作用⁷的代谢。这要求领导，在过去10至15年，以代谢研究在生物学^8,9的许多分支的复兴。虽然古典代谢的研究往往集中在特定途径的细节，新的代谢途径是面向正在考虑组织的全球性代谢谱的全方位调查。这个概念的一个后果是用于分析工具，最大限度地减少对特定的代谢途径和/或类型的化合物的偏压明显需要。然而，传统的生化测定是基于需要进行化验之前被指定的特定分析物的特定的化学反应。其中每一个与此相反，如核磁共振（NMR）光谱法和质谱（MS）（ⅰ）的光谱技术是基于生化化合物的特定分子（物理）性能产生了一个或若干个不同信号中的频谱在一个实验的过程中检测到的;以及（ii）检测大量每个实验的不同化合物。

因此，每一个光谱包含代谢物的整个范围的综合信息。出于这个原因，光谱方法可用于代谢组适当的工具，如不事先选择需要进行关于分析物的性质进行测定⁸ 。其结果是，这些技术自然地借给自己探索性的研究，因为它们极大地方便了意想不到的代谢变化的检测。

虽然NMR光谱法和质谱可以互换使用，用于许多代谢物的分析中，每个方法具有特定的优点和缺点，最近已审查^10。简言之，核磁共振光谱，通常可以从粗提取物中进行，且不需要样品化合物的分析前的色谱分离。相比之下，MS可与气体或液体色谱（GC或LC）分离，除去最近特别发展，如质谱成像。在一些特殊情况下，如糖 ​​的分析，液相色谱分离可能成为一种必然的核磁共振光谱为好，因为不同的糖的共振线质子显著重叠^（1H）NMR谱。然而^，1 H NMR光谱没有字符omatographic分离仍然是最流行的，几乎普遍应用代谢组学核磁共振方法。通常，样品制备是更费时和复杂的MS比为核磁共振光谱。由于基体效应的严重问题是许多在NMR谱，其中它们可以导致相当衰减的信号不太常见的比在MS。代谢物的定量可以用任何一种方法来实现。然而，需要为MS多种标准化合物由于变化的代谢物之间的基体效应和离子化效率。与此相反，每个样品只有一个标准是需要的NMR波谱分析，因为在适当的测量条件下，后者的方法在本质上是定量由于通过所观察到的细胞核的严格线性的核磁共振响应。 NMR的主要缺点是其相对低的灵敏度。 MS，尤其是LC-MS，是由数个数量级比核磁共振更敏感;因为这个原因，MS要优于核磁共振对分析在非常低的浓度存在的化合物。另一方面，在NMR实验的无损性质是通过MS具有明显的优势;以这种方式，NMR可以反复对同一样品， 例如进行，不同的NMR活性核，例如¹ H，磷^-31（31 P），碳^-13（13 C），氟^-19（19 F）的等 ，如无材料以NMR消耗相对于MS的测量。

既NMR和MS可以在不同的模式下被使用，每一个是最适合于特定化学特性的化合物的检测。例如^，31 P NMR往往更适合于¹ H-NMR进行的适度浓缩的磷酸化化合物的分析，虽然几乎所有的磷酸化代谢物还含有质子。然而，它们的¹ H NMR信号可以通过从其它的非磷酸化的化合物的¹ H NMR信号被遮蔽，而后者则显然不会造成在³¹ P NMR谱的背景信号。在模拟的情况下^，19 F NMR分析是优选的氟化合物， 如氟化的药物（从内源性代谢物没有背景信号），而¹³ C-NMR的特例是感兴趣的几乎全部，如果¹³ C-命运标记的外源性代谢前体需要遵循，由于¹³ C同位素（ 约 1％）的极低的天然丰度。许多质谱仪在任负离子模式或正离子模式下工作。因此，重要的是要知道前面的分析是否被观察的离子是带负电或带正电的。我们在此关注的协议对脑组织代谢的通过¹ H和³¹ P NMR光谱法的分析，因为这种方法会产生在（ⅰ）需要的样品制备时间方面有大量的重要代谢物浓度以低成本ND所需的代谢物的定量（ⅱ）的努力。所有实验中可以使用一个标准的湿化学实验室的设备和高分辨率核磁共振光谱设施来进行。而且要求在下面的协议部分进行了描述。

研究方案

注:动物伦理声明
在大鼠动物实验其次在法国有效的指导方针，并经当地伦理委员会（＃40.04，埃克斯 - 马赛大学医学院，法国马赛​​）。

1，采收和冷冻鼠脑

1. 在杜瓦液态氮（N _2liq）足够大，以保持冷冻钳（至少2-3升容积）;:准备所需物品麻醉剂（ 如异氟醚或氯胺酮/甲苯噻嗪）;麻醉室;无菌清扫工具:手术剪，手术刀，镊子;组织湿巾和瓶子清洗酒精（乙醇）;针状物（25克）; 1毫升和10毫升注射器。标签铝板（ 约 10×10厘米）胶带。用床单包裹个别冻结钳位大鼠大脑。
   注意:要处理的液氮时戴上防护手套和防护眼镜或面罩！
2. 填写杜瓦用N _2liq，并将免费ZING夹在杜瓦。确保_Ñ2liq在杜瓦的量是足够的重复冷冻-钳程序（几升; N _2liq各冷冻夹紧过程中蒸发的量取决于夹具的大小）。
3. 麻醉动物（ 例如 ，异氟醚，或腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物）。通过心脏穿刺进行安乐死，以防止出血时，头皮被删除，颅骨被打开。 步骤1.4-1.7下面描述这个标准程序。
   请注意:在需要葡萄糖和高能量的代谢物，牺牲的大鼠的最大保存由漏斗冷冻麻醉动物用N的大脑特殊协议头皮的回缩后_2liq ^11。然后，解剖出脑颅骨下间歇_Ñ2liq，以减少事后的新陈代谢^12。
4. 滋润鼠头清洗酒精。用手术剪刀（一）REMOVE头皮，沿颅缝（二）开放性颅骨。
5. 使用镊子，以进一步打开颅骨，并从开放性颅骨下方取出整个大脑，定位头倒立。迅速取出的血液，利用组织湿巾任何可见的痕迹。如果脑半球在代谢和形态对称，很方便它从另一个半球通过切口用手术刀分离后使用半球代谢分析中的一个。如果需要，使用其他脑研究，如组织学检查剩余的半球。
6. 快速去除冻结从N个_2liq钳-filled杜瓦，将整个或半个老鼠大脑的一个内表面，钳，立即将冻结夹成N _2liq -filled杜瓦按住钳紧紧压缩。确保步骤1.3-1.6时间不超过60秒。
7. 之后从杜瓦，开钳1-2分钟捞出冷冻钳，拧松钳冰冻脑组织和包装在适当标记的铝板冷冻组织（见1.1以上）。确保标签是清晰可辨的样品缠绕后固定到位停留。快速放置于N _2liq包装样品。尽可能快地执行整个程序，以避免冷冻脑组织解冻。
8. 存储的N _2liq或冷冻在-80°C，直到代谢物提取冷冻样品。
   注意:每当一个生物样品是要存放一年以上，存储在N个_2liq温度是优选于-80℃。这也适用于该协议的其余部分。

2，准备代谢物的提取程序

1. 制备组织匀浆器和匹配的试管（ 例如为10毫米内径，取决于均化器轴的直径，通常由塑料制成）。使用电气均质而不是手动驱动均质（组织研磨）。预削减涡旋和实验室的平衡。
2. 准备水桶装满碎冰。保持在冰上（4各1ml每250-350毫克冷冻的脑组织）的甲醇，氯仿和水充分quantitites。
3. 准备移液管和药瓶。
   1. 准备玻璃小瓶（≥20毫升体积）的螺纹瓶盖，置于冰上（每个组织提取液1瓶）。飞度螺丝帽带特氟龙隔耐氯仿。
   2. 配制成5毫升塑料移液管用于分配的甲醇和水，和玻璃移液管或汉密尔顿注射器用于分配氯仿。准备额外的塑料移液管（5或10 ml，此）用于将组织匀浆和甲醇的混合物。
   3. 确保所有的玻璃器皿用蒸馏水彻底冲洗，并在使用前仔细干燥以除去微量杂质，特别是NMR可检测的甲酸盐和乙酸盐。
4. 填写瓷砂浆用N _2liq，地点瓷杵在砂浆填充用N2 _升智商。氮会蒸发，直到研钵和杵的温度充分低。请砂浆少量正_2liq的。

3，提取代谢物

1. 从存储（N _2liq罐或-80℃的冰箱中）取出冷冻的脑组织样本。然后，马上转移组织样本砂浆部分填充有N _2liq。
2. 使用n _2liq -冷杵打破冰冻脑组织成更小的碎片，很容易融入用于组织同质化的试管。为了防止冷冻组织块从所投影出来的过程中砂浆的，打破了组织，而仍然被包在铝薄片。不研磨冷冻的组织以粉末，因为这将使得转移到试管更加困难（水凝结的风险增加）。重要提示:在整个过程中，增加N _2liq根据需要保持样品速冻砂浆。
3. 混合Š商场件冷冻脑组织彻底，称取250-350毫克以及转移到一个试管充满冰冷甲醇（4ml为250-350毫克的脑组织）。每当件冷冻组织的加入，用组织匀浆器立即均匀这些。
   注意:快速完成这整个过程，以避免（ⅰ）的水显著缩合上，这将导致在样品重量的过高估计，并且将样品的（ⅱ）加热和解冻的样品。个人组织片应该是在冷冻状态下的均质化过程的开始。
4. 之后的最后一块冷冻大鼠脑样品的已被添加到试管中，并匀化，匀浆转移到≥20毫升容积的玻璃小瓶中，靠近螺丝帽，并让在冰上放置15分钟。如果测试管的体积不足够大的≥4毫升甲醇中，使用较小的甲醇量均匀化的冷冻脑组织的一部分，将混合物转移到玻璃小瓶中，并继续均质化残余组织碎片用新鲜甲醇。确保总的甲醇量为每250〜350毫克的脑组织4毫升。
5. 添加冰冷的氯仿（ 即 ，每250〜350毫克的脑组织4ml）中对组织匀浆，涡流彻底相同体积并让在冰上放置15分钟。
   注:处理挥发性溶剂，特别是氯仿时，必须使用化学通风罩！
6. 添加的水的体积相同（ 即 ，每250〜350毫克的脑组织4ml）中对组织匀浆，涡流透，静置在-20℃下过夜。

4，准备阶段的分离和溶剂挥发

1. 制备冷离心机（4℃，13000 XG在最大半径）和离心管中。确保后者≥20毫升的量，耐氯仿，并能承受13000×g的离心力。使用专用的玻璃离心管，但冲洗（因为所有的玻璃器皿）用蒸馏水前使用（见2.3）。
2. 备中彻底清洗的玻璃巴斯德移液管和适当propipettor（灯泡，手动移液管泵，自动吸管辅助/移液器等 ）。
3. 准备两个额外彻底冲洗管（≥15毫升体积）每脑样品，其中之一必须是耐氯仿（由玻璃或聚四氟乙烯），另一种在甲醇（由塑料制成的耐甲醇，或玻璃）。
4. 制备溶剂蒸发装置（市售或自制的）。确保此装置提供干燥的氮气的精细控制流被引导到的含有挥发性溶剂（甲醇，氯仿）提取物溶液的表面上。
5. 准备装满冰两个附加的盘或轮叶:一个用于样品传输在冰上，而另一个用于保持样品冷过程中的蒸发过程。
6. 准备冻干机（冷冻机）及所需材料冻干:（i）在50毫升离心管或真空每提取圆底烧瓶中，以及（ii）N _2liq冻结的样品的水相（每个样品≤0.3L）。如果离心管的情况下，也准备适合于冻干机宽颈真空过滤瓶。

5相分离和溶剂蒸发

1. 为完全的相分离，转移的甲醇/氯仿/水/脑组织匀浆（见3.6），以氯仿-耐离心管（≥20毫升体积）和离心机以13,000 XG和4℃下进行40分钟。
   注:两个阶段将形成，由一层沉淀蛋白质的分离。下部（重）相由甲醇，氯仿，溶解脂质，而上（轻）相由水，甲醇，溶解水溶性的代谢物。
2. 用巴斯德吸管的上端相转移到一个适当的≥15ml管（塑料耐甲醇，或玻璃）。保持在ICE。
3. 使用新鲜的巴斯德吸管下相转移到合适的≥15ml管（玻璃或铁氟龙）。保持在冰上。
4. 储存沉淀的蛋白的层在-80℃下，如果它是用于测定总蛋白质;否则丢弃。
5. 保持该管的水/甲醇相（见5.2）在冰上并通过引导干燥氮气流上提取溶液的表面蒸发甲醇。或者，通过将萃取溶液轻轻泡氮气。终止该蒸发过程中，当氮气鼓泡不再导致在萃取溶液体积减少。此时，继续进行冷冻干燥（见5.7），或冷冻，保持样品在-80℃下用管闭合（螺旋盖或封口膜），直到准备用于冻干。
6. 将管与甲醇/氯仿相（见5.3）在冰上并通过引导干燥氮气流到ス蒸发甲醇rface萃取溶液。当所有的溶剂被蒸发，终止该过程，并保持该样品在-80℃下用管闭合（螺旋盖或封口膜），直到准备用于NMR分析。
7. 准备水相冻干
   1. 甲醇蒸发过程结束时（见5.5）后，将样品转移到一个彻底清洗50ml离心管中（如果该样品被冻结，解冻之前传输）。或者，传送到真空圆底烧瓶中。
   2. 通过旋转离心管（或圆底烧瓶）部分地插入于N _2liq使得管或烧瓶的内表面逐渐覆盖冷冻液冷冻萃取溶液。确保不施氮_2liq。可以输入插座。
   3. 当所有的液体冻结，盖上盖子刺破或螺丝帽管，使蒸汽逸出，然后将管子的宽颈真空过滤瓶。
   4. 阿塔后开始冻干清烧瓶或瓶子的冷冻干燥机。
8. 终止冻干过程时，样品是完全干燥的。保持样品在-80℃下在封闭管（带有紧帽！），直到用于NMR分析。
   注:一般不超过24小时，需要为冻干。几个样品能同时被冻干，取决于冷冻干燥机的设计，并在宽颈瓶或圆底烧瓶离心管中是否被使用。

6，准备核磁共振样品

1. 商店干燥并在非常低的温度下冷冻干燥萃取物（≤80℃）。重新溶解的冻干紧接核磁共振实验前的准备核磁共振样品。
   注:储存在溶液和/或接近室温的样品，可能导致样品降解！
2. 制备螯合剂，反式1,2 - cyclohexyldiaminetetraacetic乙酸（CDTA）的水溶液200mM的溶液，如下所示:
   1. 加入纯净水（ 例如 ，20ml）溶液到试管或离心管中，并添加必要的，以产生200mM的溶液CDTA粉末的量。
      注:CDTA的很大一部分将不溶性的，因为pH值是非常低的，因为使用了CDTA的酸的形式，而不是一个CDTA盐。
   2. 小心加入，一步一个脚印，CsOH的粉量增加的全面性协定的解决方案，以及涡每次加入后彻底。
      注:水溶性CDTA分数将与该水溶液中增加的CsOH含量增加。避免"overtitration"， 即比的CsOH到CDTA溶液中的化学计量量的添加量少。
   3. 当几乎所有的全面性协定粉末溶解，每次启动的CsOH此外，彻底混匀后测量pH值。终止的CsOH此外，当最终的pH达到（ 表1）。
      请注意:这时，所有的CDTA将被溶解。利用^铯作为抗衡，以全面性协定是根儿盟友优于^钠或^钾离子。 ^铯是柔软的路易斯酸的离子半径大，因为，相对于Na ⁺和K ⁺具有较小的离子半径和硬酸。因此， ^铯形成复合物与磷酸盐（强碱）不太容易做的比Na ⁺和K ^+。这是有利的，对磷酸化代谢产物的³¹ P NMR谱，因为络合趋于增加NMR线宽，特别是慢于中间离子交换的条件下。
3. ³¹ P NMR磷脂分析（PL），溶解干燥脂质（见5.6）在700微升的溶剂混合物的组成氘代氯仿（CDCL _3），甲醇与如上述制备的CDTA溶液6.2（5:4:1体积比）。将样品转移到离心管中。使用直接位移（或正排量）微量吸管，用氯仿 - 抗蚀蚂蚁提示在这两个步骤。
   注:请记住，改变下列任何参数会影响PL ³¹ P NMR谱^13-17外观（化学位移和线宽）:
   （一）体积比CDCL _3:甲醇:全面性协定解决方案
   （ⅱ）溶剂总体积中使用
   （ⅲ）pH值的溶剂的含水组分的
   （ⅳ）CDTA浓度的溶剂的水性组分。
   请注意:一般来说，微调这些样本的参数（ 表1）是没有必要的，并且应该根据需要在某些特殊情况下非常小心地进行。改变溶剂的体积比容易导致组成的两相，而不是一个均相体系的形成！单相系统被认为是比在大多数应用^13,14的两相体系更为实用。
4. 为水溶性的代谢产物的¹ H NMR分析，溶解在冷冻干燥（见5.8）加入700μl重水（D ₂ O）含有3（三甲基硅烷基）丙- 2,2,3,3-D4酸钠盐（TSPD _4）中的毫摩尔范围（D ₂含0.05％TSPD ₄ O是可商购） 。将样品转移到离心管中。
5. 通过加入氯化氘（DCL）和钠氘（NaOD）溶液少量（ 约 2微升）调节得到的水提取液的pH至7.3。首先，先从0.02N的DCL或NaOD解决方案。如果2个或3后续补充不引起足够的pH值的变化，继续用0.2N DCL或NaOD解决方案。要小心，不要overtitrate。
   备注:DCL或NaOD溶液所需的总数量取决于提取脑组织的量;注意这个值进行精确的代谢产物定量。在大多数情况下，所添加的DCL和NaOD解决方案的组合体积应几乎可以忽略不计（NMR样品体积的近1％）。

³¹ P NMR实验脑磷脂分析^13,14书名"> 7。性能

1. 为获得最佳效果，请使用多核高分辨率核磁共振光谱仪（≥9.4特斯拉的磁场强度，相当于162 MHz的³¹ P或400 MHz的^1小时共振频率）。除了^​​31 P线圈，确保³¹ P NMR探头拥有^1小时线圈质子去耦。核磁共振探测到期望的目标值（通常是25℃）的设定温度调节。
   注:探头温度可能需要10〜20分钟，以稳定！
2. 在离心管中离心的PL提取液（见6.3），在4℃下11000×g离心30分钟，降速样品中的固体残渣。转移600μl的上清液，以高品质的NMR管件（5mm外径）。
3. 准备适当的同轴插入杆填充有水的20mM亚甲基二（MDP）的溶液在pH为7.0的化学位移参考和定量。把这个插在核磁共振管内充满PL提取液。
4. 适合的NMR管中与适当的纺丝器和转移到NMR磁体。现在旋转的样品在15-20赫兹，等待样品已调节至设定温度（ 约 10分钟）。
5. 小心地通过调节轴上和离轴的匀场线圈的电流¹⁸可最大限度地降低样品的磁场不均匀性。
6. 设置NMR谱采集参数为最佳值，这可能由于磁场强度（用于9.4 T系统见表1推荐的参数值）的函数而变化。
7. 每个实验（= NS）的瞬态定数。
   1. 设置NS至约80（总的数据采集约 20分钟的持续时间），如果仅最普遍的伪卫星是与精度进行定量（磷脂酰胆碱（PtdCho），磷脂酰乙醇胺（PtdEtn），乙醇胺缩醛磷脂）。
   2. 设置ns至约100-200（共计D的持续时间ATA采集1-2小时），如果浓度较低的伪卫星都被定量（烷酰基磷脂酰胆碱，磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酸）。
   3. 设置NS至约1,500-2,000（总的数据采集7-10小时的持续时间;过夜试验）如极低浓度伪卫星是进行定量， 例如 ，磷脂酰肌醇的单和二磷酸酯（PtdIP和PtdIP _2），心磷脂，溶血PL的，烷酰基磷脂酰乙醇胺，偶尔他人。
8. 谱获取，使用优化的参数过程中自由感应衰减（FID）的端部之后。这些参数的值发生变化，作为磁场强度，垫片质量和PL信号的函数来进行定量。
   1. 要获得最佳效果的伪卫星的整个范围，重复使用多个处理（至少两个）不同的过滤程序。使用强大的分辨率增强为强烈信号重叠， 如为PtdCho和PtdEtn地区。
   2. 使用过滤强（弱或没有提高分辨率）的微弱信号。
   3. 滤除不通过变迹显著重叠（ 例如 ，LB = 3赫兹）非常弱，宽信号，以提高信号的信噪比， 例如 PtdIP和PtdIP _2。 表1为特征的加工参数。
9. 相对于在相同的频谱中的参考化合物（MDP）的信号下的面积量化每个PL信号的区域。
10. 校准在一个单独的实验中参考化合物（MDP）的信号，使用5mm NMR管填充（I）已知浓度的磷化合物，及（ii）同在PL ³¹ P NMR实验中使用同轴电缆插入杆（见7.3和7.9）。
11. 计算各个PL浓度根据一方面（见7.9）的PL信号的相对区域，以及从得到的MDP校准值另一方面同轴插件（请参阅7.10）。考虑到磷核促进特定的³¹ P NMR信号的数量可以作为该信号的分子原点的函数而变化。
    注:MDP膦信号（通常是参照19.39 PPM）代表两个磷原子核，一样的心磷脂磷酸信号。在脑提取物检测到的所有其他PL ³¹ P NMR信号代表一个磷核每个。
12. 需要比较的动物群之间的大脑特等级别使用的统计软件。

¹ H NMR的试验的水溶性脑代谢物分析的8性能

1. ¹ H NMR的探测到期望的目标值（通常是25℃）的设定温度调节。另请参见备注在7.1。
2. 在4℃和11000离心机中离心管（见6.5）的水提取物溶液xg离心30分钟，以降速样品中的固体残余物​​。转移600μl的上清液，以高品质的NMR管件（5mm外径）。
3. 转印NMR管进行NMR磁体，垫片和在7.4-7.6说明设置NMR光谱采集参数为最佳值。另请参阅表1推荐的参数值。
4. 每个实验瞬变的数量设定为NS = 32（数据采集约 13分钟的总时间）。为了获得良好的信号与噪声的比率非常微弱的信号，尤其是在芳族区域，使用NS =以上64（数据采集约 26分钟的总时间）。
5. 谱获取，使用优化的参数过程中自由感应衰减（FID）的端部之后。这些参数的值稍有不同的磁场强度，垫片质量和代谢物信号的函数来进行定量。
   注意:在大多数情况下，它足以处理每个频谱一次，采用了一套加工参数提出一个很好的妥协为所有代谢产物的信号。 表1为特征的加工参数。
6. 量化每种代谢物的信号的区域（通常是一个多峰，有时与其他单峰或者多峰从不同的分子所产生的重叠），相对于在相同的频谱中的参考化合物（TSP-D _4）的信号下的面积。
7. 计算基于TSP-D浓度₄个人代谢物浓度（见6.4）。考虑到质子有助于特定的¹ H NMR信号的数量可以作为该信号的分子原点的函数而变化。利用TSP-D ₄三信号（参考0.0 PPM）代表9个质子。
8. 需要比较的动物群之间的大脑代谢水平使用统计软件。

结果

为了获得最佳的分辨率在脑和其它组织提取物的代谢NMR谱，这早已是普遍的做法，以消除或掩蔽的金属离子（最重要的是:顺磁性离子）存在的提取液。这已经实现或者通过添加螯合剂，如EDTA或CDTA的提取物^19，或通过将提取物通过离子交换树脂，如CHELEX-100 ^20。在图1中呈现的结果表明，该步骤不是必需的¹ H NMR光谱分析，如果脑提取物是根据上述协议精心的准备...

讨论

NMR光谱法是用于测量溶液中的化学化合物的浓度在很重现的和准确的方式的一种有效方法。然而，为了获得高质量的数据，必须坚持有关样品制备和分析的某些规则。中代谢物浓度的NMR谱的测定，既不产生也不NMR信号的接收占主导地位的定量误差，除非观察到的信号的强度接近的检测阈值（特别是弱信号）。在所有其他情况下的生物变异性，样品制备技术（提取效率，化合物的物理和化学稳定性...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15 ml, 30 ml tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor
Polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10 ml volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96% deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96% deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20% in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30% in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Research	With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913