ניתוח metabolomic של מוח חולדה על ידי ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית הגרעינית ברזולוציה גבוהה של תמציות רקמות

Summary

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Abstract

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Introduction

מודלים עכבריים כבר נוצלו בהרחבה בחקר מוח ^1. מתאמי גנוטיפ, פנוטיפ נחקרו במוח עכבר וחולדה על ידי לימוד ביטוי גנים בRNA ו / או רמות חלבון מצד האחד, ופנוטיפים מורפולוגיים, תפקודיים, אלקטרו ו / או התנהגותי על ^2-6 האחר. עם זאת, כדי להבין את המנגנונים המקשרים פנוטיפ לגנוטיפ לחלוטין, זה הכרחי כדי לחקור את האירועים המולקולריים במורד הזרם של ביטוי חלבון, כלומר. חילוף החומרים של מצעים ביוכימיים שעליו אנזימים לפעול ^7. דרישה זו הובילה, על 10 עד 15 השנים האחרונות, לרנסנס של מחקר מטבולים בענפים רבים של ^8,9 ביולוגיה. בעוד שמחקרים מטבוליים קלאסיים פעמים רבות מתמקדים בפרטים של מסלולים ספציפיים, גישת metabolomic החדשה מיועדת לחקירה כוללנית של הפרופיל המטבולי הגלובלי של הרקמה תחת שיקול.אחת תוצאות של תפיסה זו היא צורך ברור לכלים אנליטיים שלמזער את ההטיה לכיוון מסלולי מטבוליים ספציפיים ו / או סוגי תרכובות. עם זאת, assay ביוכימיים קלאסי מבוסס על תגובה כימית מסוימת של אנליטי ספציפי שצריך להיות מוגדרים לפני assay מבוצע. בניגוד לכך, טכניקות ספקטרוסקופיות כגון תהודה מגנטית ספקטרוסקופיה הגרעינית (NMR) וספקטרומטריית מסה (MS) (i) מבוססות על מאפיינים מסוימים מולקולריים (פיזיים) של תרכובות ביוכימיות, כל אחד מהם מעורר אותות אחד או כמה ברורים בספקטרום זוהה במהלך ניסוי אחד; וכן (ii) לזהות מספר רב של תרכובות שונות לכל ניסוי.

לפיכך, כל ספקטרום מכיל מידע המשולב של מגוון רחב של מטבוליטים כל. מסיבה זו, שיטות ספקטרוסקופיות הם כלים נאותים לmetabolomics, כמו שאף בחירה לפני צריכה להיעשות לגבי אופי אנליטי כדי להימדד ⁸ . כתוצאה מכך, הטכניקות הללו באופן טבעי להשאיל את עצמם ללימודי חיפושי נפט מכיוון שיקלו על זיהוי של שינויים מטבוליים בלתי צפויים במידה רבה.

למרות ספקטרוסקופיה NMR וMS ניתן להשתמש לסירוגין לניתוח מטבוליטים רבים, כל שיטה הוא בעל יתרונות וחסרונות לאחרונה כי נבדקו ¹⁰ ספציפיים. בקצרה, ספקטרוסקופיה NMR יכולה בדרך כלל להתבצע מתמציות גולמיים ואינה דורשת הפרדת chromatographic של תרכובות מדגם לפני הניתוח. בניגוד לכך, MS עובד עם גז או כרומטוגרפיה נוזלית (GC או LC) הפרדה, למעט התפתחויות מסוימות האחרונות כגון הדמיה ספקטרומטריית מסה. בכמה מקרים מיוחדים, כגון הניתוח של סוכרים, הפרדת LC עשויה להיות הכרח עבור ספקטרוסקופיה NMR, כמו גם, כי קווי התהודה של סוכרים שונים חופפים באופן משמעותי בפרוטון ⁽¹ H) NMR ספקטרום. אף על פי כן, ספקטרוסקופיה H NMR ¹ ללא chrהפרדת omatographic נשארה השיטה הפופולרית ביותר, כמעט אוניברסלי השימושית metabolomic NMR. באופן כללי, הכנת מדגם היא יותר זמן רב ומורכב עבור MS מאשר לספקטרוסקופיה NMR. בעיות חמורות בשל השפעות מטריצה ​​הן הרבה פחות נפוצות בספקטרוסקופיה NMR מאשר בטרשת הנפוצה שבו הם עלולים להוביל לאותות משמעותי מוחלשים. quantitation המטבוליט ניתן להשיג גם עם שיטה. עם זאת, תרכובות סטנדרטיים מרובות נדרשות עבור MS עקב שינויים בהשפעות מטריצה ​​ויעילות יינון בין מטבוליטים. לעומת זאת, רק אחד סטנדרטית לדגימה דרושה לניתוח ספקטרוסקופיות NMR כי בתנאי מדידה מתאימים, השיטה השנייה היא מהותית בזכות כמותיים לתגובת NMR ליניארי בקפדנות על ידי הגרעינים שנצפו. חסרון עיקרי של NMR הוא הרגישות הנמוכה יחסית שלה. MS, בLC-MS בפרט, הוא רגיש יותר מתמ"ג על ידי צווים שונים של גודל; מסיבה זו, הטרשת הנפוצה היא להיות מועדפת על פני NMR לניתוח של תרכובות המתרחשות בריכוזים נמוכים מאוד. מצד השני, הטבע הורסות של ניסוי NMR הוא יתרון ברור על פני MS; בדרך זו, ניתן לבצע NMR שוב ושוב על אותו המדגם, למשל, לגרעיני NMR פעיל שונים כגון ¹ H, זרחן 31 ב( ^{31 בP),} פחמן -13 (C ^13), פלואור-19 ⁽¹⁹ F) וכו '., כמו שאף חומר הנצרך על ידי NMR בניגוד למדידות MS.

יכולים להיות מועסק NMR וMS הן במצבים שונים, כל אחד מהם להיות אופטימלי לזיהוי של תרכובות עם מאפיינים כימיים מסוימים. לדוגמא, ^{ביום 31 בP} NMR הוא לעתים קרובות מתאים יותר ^מ1 H NMR לניתוח של תרכובות פוספורילציה מרוכזות במתינות, אם כי מטבוליטים כמעט כל פוספורילציה גם מכילים פרוטונים. עם זאת, ¹ אותות H NMR שלהם עשויים להיות מוסתרים על ידי ¹ אותות H NMR מתרכובות אחרות, שאינה פוספורילציה, ואילו האחרוניםברור שאתה לא לגרום לאותות רקע ^{ביום 31 בספקטרום} P NMR. במצב אנלוגי, ¹⁹ ניתוח F NMR יש להעדיף לתרכובות פלואור, למשל, תרופות פלואור (אין אותות רקע ממטבוליטים אנדוגני), ואילו במקרה המיוחד של ¹³ C NMR הוא עניין כמעט אך ורק אם גורלו של ¹³ C- מבשרי חילוף חומרים אקסוגניים שכותרת צריך להיות אחרי, בשל השפע הטבעי הנמוך מאוד של איזוטופ ¹³ C (בערך 1%). ספקטרומטרים המוניים רבים לעבוד במצב או יונים שליליים או במצב יון חיובי. לכן, חשוב לדעת מראש את הניתוח אם היונים כדי לצפות חיוב או לשלילה יחויבו. אנו מתמקדים כאן בפרוטוקול לניתוח metabolome רקמת המוח על ידי H ^{1 ויום 31 בספקטרוסקופיה} P NMR כי שיטה זו מניבה מספר גדול של ריכוזי המטבוליט חשובים בעלות נמוכה במונחים של זמן (i) דרוש למדגם הכנהnd (ii) מאמץ הנדרש כדי לכמת את המטבוליט. ניתן לבצע את כל הניסויים באמצעות הציוד של מעבדה כימיה רטובה סטנדרטית ומתקן ספקטרוסקופיה NMR ברזולוציה גבוהה. דרישות נוספות המתוארים בסעיף הפרוטוקול להלן.

Protocol

הערה: מסר של בעלי החיים אתיקה
מחקרים בבעלי חיים על חולדות ואחרי ההנחיות תקפות בצרפת, ואושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית (# 40.04, אוניברסיטת בית הספר לרפואת Aix-Marseille, מרסיי, צרפת).

.1 קצירה והקפאת מוח חולדה

1. הכן פריטים דרושים: חנקן נוזלי _{(2liq N.)} בדיואר כי הוא גדול מספיק כדי לשמור על מהדק הקפאה (לפחות 2-3 L נפח); הרדמה (למשל, isoflurane, או קטמין / xylazine); תא הרדמה; כלים סטריליים לנתיחה: מספריים כירורגיות, אזמל, מלקחיים; מגבוני רקמה ובקבוק עם ניקוי אלכוהול (אתנול); מחטים (25 G); 1 מ"ל ו10 מ"ל מזרקים. גיליונות אלומיניום לייבל (בערך 10 x 10 סנטימטר) עם סרט דביק. השתמש בגיליונות לעטוף את מוח של חולדה הקפאה-הדק בודדת.
   הערה: תמיד ללבוש כפפות מגן ומשקפי מגן משקפי מגן או מסיכה בעת טיפול חנקן נוזלי!
2. מלא דיואר עם _{2liq N.} ומקום חינםמהדק זיע בדיואר. ודא את כמות _2liq N בדיואר מספיק לנוהלי הקפאת מהדק חוזרים ונשנים (כמה ליטרים; הסכום של _2liq N מתאדה במהלך כל הקפאה-הידוק תלוי בגודל של המהדק).
3. הרדימי בעלי חיים (למשל, על ידי isoflurane, או על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין / תערובת xylazine). המשך להמתת חסד על ידי לנקב לב כדי למנוע דימום כאשר הקרקפת מוסרת וגולגולת נפתחה. צעדים 1.4-1.7 להלן מתארים הליך סטנדרטי זה.
   הערה: בפרוטוקולים מיוחדים הדורשים שימור מרבי של מטבוליטים גלוקוז ואנרגיה גבוהה, עכברוש הקרבה על ידי המוח של החיה המורדמת עם N הקפאה-משפך _2liq ¹¹ לאחר הנסיגה של הקרקפת. לאחר מכן, לנתח מוח מהגולגולת מתחת _2liq N לסירוגין כדי למזער את חילוף החומרים שלאחר המוות ^12.
4. להרטיב את הראש של חולדה עם ניקוי אלכוהול. השתמש במספרי כירורגיות לrem (i)קרקפת אובה, וכן (ii) גולגולת פתוחה לאורך תפרי גולגולת.
5. שימוש במלקחיים כדי לפתוח גולגולת נוספת, וכדי להסיר כל המוח מתחת לגולגולת הפתוחה, מיצוב הראש במהופך. להסיר במהירות כל עקבות גלויות של דם באמצעות מגבוני רקמה. אם אונות המוח הן מטבולית ומורפולוגית סימטריות, זה נוח להשתמש באחד מהחצאים המוח לניתוח מטבולים לאחר הפרדתו מחץ הכדור השני על ידי חתך עם האזמל. במידת הצורך, להשתמש בחץ הכדור שנותר ללימודים אחרים במוח כגון היסטולוגיה.
6. להסיר במהירות הקפאת מהדק _מ2liq N -filled דיואר, למקם את מוח חולדה שלם או חצי על פני השטח פנימיים אחד, מהדק ומייד להכניס להקפאת מהדק לתוך _2liq N -filled דיואר תוך החזקת מהדק דחוסה בחוזקה. ודא שצעדים 1.3-1.6 כבר לא ייקחו יותר מ60 שניות.
7. לאחר מהדק הקפאת 1-2 להסיר דקות מדיואר, המהדק פתוח, לשחרר את הרקמה קפוא מוח ממהדק, ולעטוףרקמה קפוא בגיליון אלומיניום שכותרתו כראוי (ראה 1.1 לעיל). ודא שהתווית היא קריא ונשאר במקומו לאחר המדגם עטוף. במהירות למקום מדגם עטוף _ב2liq N. לבצע את ההליך כולו במהירות אפשרית, כדי למנוע הפשרת רקמת מוח קפוא.
8. אחסן מדגם קפוא _ב2liq N או במקפיא ב-80 ° C עד מיצוי המטבוליט.
   הערה: בכל פעם מדגם ביולוגי הוא להיות מאוחסן במשך יותר משנה, אחסון בטמפרטורת _2liq N הוא להיות מועדפת על פני -80 מעלות צלזיוס. זה חל גם על השארית של פרוטוקול זה.

2 הכנת המטבוליט הפקת הנוהל

1. הכן homogenizer רקמות ומבחנות התאמה (לדוגמא, קוטר 10 מ"מ פנימי, בהתאם לקוטר של פיר homogenizer, בדרך כלל עשוי מפלסטיק). השתמש homogenizers חשמלי ולא homogenizers מונע באופן ידני (ומטחנות רקמות). טרוםלקלף vortexer ואיזון מעבדה.
2. הכן דלי מלא בקרח כתוש. שמור כל כמויות מספיקות של מתנול, כלורופורם ומים על קרח (4 מ"ל כל אחד לרקמת מוח הקפוא 250-350 מ"ג).
3. הכן טפטפות העברה ובקבוקונים.
   1. הכן בקבוקוני זכוכית (≥20 מ"ל נפח) עם פקקי הברגה ומניחים על קרח (בקבוקון אחד לכל תמצית רקמה). בורג Fit כובעים עם septa טפלון עמיד לכלורופורם.
   2. הכן 5 מ"ל טפטפות פלסטיק לבקבוק מתנול ומים, וטפטפות זכוכית או מזרקים המילטון לבקבוק כלורופורם. הכן טפטפות נוספת פלסטיק (5 או 10 מ"ל נפח) להעברת תערובות של homogenate ומתנול רקמה.
   3. ודא שכל כלי הזכוכית היא שטף ביסודיות עם מים מזוקקים ומיובשת היטב לפני השימוש כדי להסיר עקבות של זיהומים, בעיקר formate ויצטט NMR-לזיהוי.
4. מלא מרגמה פורצלן עם _2liq N, העלי פורצלן מקום במרגמה ולמלא עם _2L NIQ. חנקן יתאדה עד הטמפרטורה של מכתש ועלי היא נמוכה מספיק. שמור כמות קטנה של _2liq N במרגמה.

.3 הפקת מטבוליטים

1. הסר דגימת רקמת המוח קפוא מאחסון (טנק _2liq N או במקפיא -80 מעלות צלזיוס). לאחר מכן, להעביר באופן מיידי דגימת רקמת מרגמות באופן חלקי מלא _2liq N.
2. השתמש העלי -cold _2liq N לשבור את רקמת המוח הקפואה לחתיכות קטנות יותר, כי בקלות להשתלב במבחנות המשמשות ליצירת הומוגניות רקמה. כדי למנוע חתיכות של רקמה קפוא מלהיות מוקרן מהמרגמה בתהליך, לשבור את הרקמה כשהוא עדיין עטוף ברדיד אלומיניום. אל תשחק את הרקמה קפוא לאבקה כמו זה יגרום העברה למבחנה (סיכון מוגבר לעיבוי מים) יותר קשה. חשוב: לאורך כל ההליך, להוסיף _2liq N מרגמות לפי צורך כדי לשמור על המדגם הקפוא עמוק.
3. מיקס שלחתיכות קניון של רקמת מוח קפוא ביסודיות, שוקלות את 250-350 מ"ג ולהעביר למבחנה מלאה במתנול קר כקרח (4 מ"ל לרקמת מוח 250-350 מ"ג). כל חתיכות של רקמה קפוא זמן מתווספות, homogenize אלה מייד עם homogenizer הרקמות.
   הערה: השלם כל הליך זה במהירות כדי למנוע (i) עיבוי משמעותי של מים על המדגם שיוביל להערכת יתר של משקל המדגם, וכן (ii) חימום והפשרה של המדגם. פיסות רקמת אדם צריכה להיות במצב קפוא בתחילתו של תהליך יצירת הומוגניות.
4. אחרי חתיכת מדגם מוח חולדה קפוא האחרונה נוספה למבחנה, ומעוורים, להעביר את homogenate לבקבוקון זכוכית נפח ≥20 מ"ל, כובע בורג קרוב ולתת לעמוד על קרח במשך 15 דקות. אם הנפח של המבחנה הוא לא גדול מספיק עבור מתנול מ"ל ≥4, להשתמש קטן מתנול נפח לhomogenize חלק מרקמת המוח הקפוא, מעביר את התערובת לבקבוקון הזכוכית ולהמשיך מאחד את חתיכות רקמה שיורית עם מתנול הטרי. ודא הכולל מתנול הנפח 4 מ"ל ל250-350 רקמת מוח מ"ג.
5. להוסיף את אותו הנפח של כלורופורם קר כקרח (כלומר, 4 מ"ל ל250-350 רקמת מוח מ"ג) לhomogenate, מערבולת ביסודיות ולתת לעמוד על קרח במשך 15 דקות.
   הערה: השתמש תמיד במכסת מנוע כימי מאוורר בעת טיפול ממסים נדיפים, בעיקר כלורופורם!
6. להוסיף את אותו הנפח של מים (כלומר, 4 מ"ל ל250-350 רקמת מוח מ"ג) לhomogenate, מערבולת ביסודיות ולתת לעמוד ב-20 לילה C °.

.4 הכנת הפרדת שלב ואידוי ממס

1. הכן צנטריפוגות הקרה (4 ° C, 13,000 XG ב רדיוס מרבי) וצינורות צנטריפוגה. ודא שהאחרונים הם ≥20 מ"ל נפח, עמיד לכלורופורם, ויכולים לעמוד בכוחות צנטריפוגליים של 13,000 x גרם. השתמש בצינורות צנטריפוגה זכוכית ייעודיים אבל לשטוף (כמו כל כלי הזכוכית) עם מים מזוקקים להיותשימוש קדמי (ראה 2.3).
2. הכן טפטפות שטוף היטב פסטר זכוכית וpropipettor מתאים (הנורה, משאבה ידנית פיפטה, סיוע / pipettor פיפטה האוטומטית, וכו '.).
3. הכן שני צינורות נוספים שטוף היטב (≥15 מ"ל נפח) לדגימה מוח, שאחד מהם צריך להיות עמיד לכלורופורם (עשוי מזכוכית או הטפלון), האחר אחד למתנול (עשוי מפלסטיק עמיד למתנול, או זכוכית).
4. הכן מנגנון אידוי ממס (זמין מסחרי או homebuilt). ודא שמכשיר זה מספק זרם דק מבוקר של גז חנקן יבש שמופנה על פני השטח של פתרון תמצית מכיל ממסים נדיפים (מתנול, כלורופורם).
5. הכן שני מגשים נוספים או דליים מלאים בקרח: אחד לתחבורת מדגם על קרח, ועוד אחד לשמירת דגימות קרות במהלך תהליך האידוי.
6. הכן lyophilizer (להקפיא מייבש) וחומרים הדרושים לlyophilization: (i) אחד 50צינור מ"ל צנטריפוגות או ואקום עגול בקבוק תחתון לתמצית, וכן (ii) _2liq N להקפיא את השלב המימית של דגימות (L ≤0.3 לדגימה). אם נעשה שימוש בצינור צנטריפוגות, גם להכין רחב צוואר בקבוק מסנן האבק מתאים לlyophilizer.

.5 הפרדת שלב ואידוי ממס

1. להפרדה פאזות המלאה, להעביר את homogenate רקמת מתנול / כלורופורם / מים / המוח (ראה 3.6) לצינור כלורופורם עמיד צנטריפוגות (≥20 מ"ל נפח) ו צנטריפוגות ב XG 13,000 ו4 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
   הערה: שני שלבים יהוו, מופרדים על ידי שכבה של חלבון זירז. השלב נמוך יותר (כבד יותר) מורכב ממתנול, כלורופורם ושומנים מומסים, ואילו השלב העליון (בהיר יותר) מורכב ממים, מתנול ומטבוליטים מסיסים במים מומסים.
2. השתמש בפיפטה פסטר להעביר את השלב העליון לצינור מתאים ≥15 מ"ל (פלסטיק עמיד למתנול, או זכוכית). שמור על ice.
3. השתמש בפיפטה פסטר טרי להעביר את השלב נמוך יותר לצינור מתאים מ"ל ≥15 (זכוכית או טפלון). שמור על קרח.
4. אחסן את השכבה של חלבון זירז ב -80 מעלות צלזיוס אם זה הוא לשמש לקביעת חלבון בסך הכל; או השלך אחר.
5. שמור את הצינור עם שלב המים / מתנול (ראה 5.2) על קרח ולהתאדות מתנול על ידי הפניית זרם חנקן יבש על פני השטח של פתרון התמצית. לחלופין, בעדינות חנקן בועה דרך פתרון התמצית. לסיים את תהליך האידוי כאשר מבעבע חנקן כבר לא גורם להקטנת נפח בפתרון התמצית. בשלב זה, להמשיך בlyophilization (ראה 5.7), או להקפיא ולשמור מדגם ב -80 מעלות צלזיוס עם הצינור סגור (כובע בורג או Parafilm) עד מוכנה לlyophilization.
6. מניחים את הצינור עם שלב מתנול / כלורופורם (ראה 5.3) על קרח ולהתאדות מתנול על ידי הפניית זרם חנקן יבש על surface של פתרון התמצית. כאשר כל הממס הוא התאדה, לסיים את התהליך ולשמור על המדגם ב -80 מעלות צלזיוס עם הצינור סגור (כובע בורג או Parafilm) עד מוכן לניתוח NMR.
7. הכן שלב מימי לlyophilization
   1. לאחר סיום תהליך אידוי מתנול (ראה 5.5), להעביר את המדגם לצינור צנטריפוגות 50 מ"ל שטוף היטב (אם המדגם הוא קפוא, להפשיר לפני ההעברה). לחלופין, להעביר לואקום עגול בקבוק תחתון.
   2. להקפיא פתרון תמצית על ידי החלפת צינור צנטריפוגות (או בקבוק תחתון עגול) הוכנס באופן חלקי _ב2liq N כך שהמשטח הפנימי של הצינור או הבקבוק מכוסה בהדרגה על ידי נוזל קפוא. הפוך _2liq לא N _בטוח. יכול להיכנס לכלי הקיבול.
   3. כאשר כל הנוזלים הוא קפוא, לכסות את הצינור עם מכסה ניקב או כובע בורג כדי לאפשר האדים לברוח, ובמקום הצינור בבקבוק מסנן ואקום רחב צוואר.
   4. התחל lyophilization לאחר אתאצ'ינג הבקבוק או בקבוק להקפאת המייבש.
8. לסיים את תהליך lyophilization כאשר המדגם הוא יבש לגמרי. שמור את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס בצינור סגור (עם מכסה הדוק!) עד המשמש לניתוח NMR.
   הערה: בדרך כלל אין שעות יותר מ -24 נדרשת לlyophilization. ניתן lyophilized כמה דגימות בו זמנית, בהתאם לעיצוב של lyophilizer, ועל האם צינורות צנטריפוגה בבקבוקים רחב צוואר או צלוחיות תחתית עגולות המשמשים.

.6 הכנת דוגמאות NMR

1. חנות מיובשת ותמציות lyophilized בטמפרטורה נמוכה מאוד (≤-80 ° C). להתמוסס Re lyophilizates להכנת דגימות NMR מייד לפני ניסוי NMR.
   הערה: אחסון דגימות בפתרון ו / או בטמפרטורת החדר ליד עלולה לגרום להשפלת מדגם!
2. הכן פתרון מ"מ 200 מימיים chelating הסוכן, חומצת טרנס 1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic (CDTA) של, כדלקמן:
   1. מוסיף מים טהורים (לדוגמא, 20 מ"ל) לצינור מבחנה או צנטריפוגות, ולהוסיף את כמות אבקת CDTA צורך ליצור פתרון מ"מ 200.
      הערה: חלק ניכר מCDTA לא יהיה מסיס, בגלל pH הוא נמוך מאוד מאז את טופס החומצה של CDTA שימש ולא מלח CDTA.
   2. להוסיף בזהירות, צעד אחר צעד, הגדלת כמויות של אבקת CsOH לפתרון CDTA, ומערבולת ביסודיות לאחר כל ההוספה.
      הערה: חלק CDTA המסיס יגדל עם הגדלת תכולת CsOH בתמיסה המימית. הימנע "overtitration", כלומר להוסיף פחות מסכום stoichiometric של CsOH לפתרון CDTA.
   3. כאשר כמעט כל אבקת CDTA נמס, להתחיל למדוד pH לאחר כל הוספת CsOH וvortexing היסודי. לסיים בנוסף CsOH כאשר מגיע pH הסופי (טבלה 1).
      הערה: בשלב זה, כל CDTA יפורק. השימוש בCs ⁺ כcounterion לCDTA הוא generהעדיף ברית על Na ⁺ או K ^+. Cs ⁺ היא חומצת לואיס רכה בשל הרדיוס היוני הגדול שלה, בניגוד לNa ⁺ K ⁺ ושיש לי רדיוס יוני קטן יותר והן חומצות קשות. כתוצאה מכך, Cs מתחמים ⁺ צורות עם פוספטים (בסיסים קשים) פחות בקלות מאשר לעשות Na ⁺ וK ^+. זהו יתרון עבור ספקטרוסקופיה NMR ^{ביום 31 בP} של מטבוליטים פוספורילציה משום complexation נוטה להגדיל linewidths NMR, בעיקר בתנאים של איטי לחילוף יוני ביניים.
3. ^{ליום 31 בP} NMR ניתוח של פוספוליפידים (PL), לפזר שומנים מיובשים (ראו 5.6) ב700 μl של תערובת ממס בהיקף של כלורופורם deuterated (CDCl _3), מתנול ופתרון CDTA מוכן כפי שתואר ב6.2 (5: 4: 1 יחס נפח). להעביר את המדגם לצינור microcentrifuge. השתמש ישירה עקירה (או חיובי עקירה) micropipette עם כלורופורם להתנגדטיפים נמלה בשני השלבים.
   הערה: זכור כי שינוי כל אחד מהפרמטרים הבאים ישפיע על המראה (היסט כימי ורוחב קו) של ספקטרום NMR P PL ^{31 ב13-17:}
   יחס נפח (i) CDCl _3: פתרון CDTA: MeOH
   (Ii) בסך הכל נפח ממס משמש
   (Iii) pH של הרכיב המימית של הממס
   (Iv) ריכוז CDTA של הרכיב המימית של הממס.
   הערה: ב, כוונון עדין כללי של פרמטרים מדגם אלה (טבלת 1) הוא לא הכרחי, ויש לבצעו בזהירות רבה אם תרצה בכך במקרים מיוחדים. שינוי יחס הנפח בין ממסים בקלות תוצאות בהיווצרותה של מערכת המורכבת משני שלבים במקום שלב אחד הומוגני! המערכת חד השלב נמצאה להיות יותר מעשי מאשר מערכת שני שלבים ברוב היישומים ^13,14.
4. ^ל1 ניתוח H NMR של מטבוליטים מסיסים במים, מתמוסס lyophilizate (ראה 5.8) ב 700 תחמוצת דאוטריום μl מלח נתרן של חומצת propionic-2,2,3,3-D4 (D ₂ O) המכיל 3 (trimethylsilyl) (TSPd ₄₎ בטווח millimolar (D ₂ O המכיל 0.05% TSPd ₄ זמינה באופן מסחרי) . להעביר את המדגם לצינור microcentrifuge.
5. התאם את pH של תמיסת תמצית המימית וכתוצאה מכך ל7.3 על ידי הוספת כמויות קטנות (בערך 2 μl) של כלוריד דאוטריום (מת"ק) ופתרונות deuteroxide נתרן (NaOD). ראשית, תתחיל עם 0.02 N פתרונות מת"ק או NaOD. אם 2 או 3 שנוספו לאחר מכן לא גורם לשינוי רמת חומציות מספק, ימשיך עם 0.2 N פתרונות מת"ק או NaOD. היזהר שלא overtitrate.
   הערה: הסכום הכולל של פתרון מת"ק או NaOD הדרוש תלויה בכמות של רקמת המוח שחולצה; שים לב ערך זה כדי לכמת את המטבוליט מדויק. ברוב המקרים הכרכים משולבים של פתרונות מת"ק וNaOD הוסיפו צריכים להיות כמעט זניחים (קרוב ל -1% מתמ"ג נפח דגימה).

itle "> 7. ביצועים של הניסוי ^{ביום 31 בP} NMR למוח פוספוליפידים ניתוח ^13,14

1. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בספקטרומטר multinuclear ברזולוציה גבוהה תמ"ג (≥9.4 עוצמת שדה טסלה, המקביל ל162 P MHz ^{31 ב,} או 400 MHz תדרי תהודת H ^1). חוץ סליל ^{31 בP,} להבטיח כי הבדיקה ^{ביום 31 בP} NMR בעל סליל H ¹ לצימוד פרוטון. ויסות טמפרטורת סט של הבדיקה NMR לערך היעד רצוי (בדרך כלל 25 ° C).
   הערה: טמפרטורת Probe ייתכן שתהיה צורך 10-20 דקות לייצוב!
2. פתרון צנטריפוגה PL תמצית בצינור microcentrifuge (ראה 6.3) בשעה 4 מעלות צלזיוס ו11,000 XG למשך 30 דקות לספין למטה שאריות מוצקות במדגם. העבר את 600 μl של supernatant לצינור באיכות גבוהה תמ"ג (קוטר חיצוני 5 מ"מ).
3. הכן גזע להכניס קואקסיאליים מתאים מלא ב20 methylenediphosphonate מ"מ מימית פתרון (MDP) בשעה pH 7.0 להתייחסות כימית משמרתולכמת. הנח עלון זה בצינור NMR מלא פתרון תמצית PL.
4. התאם את צינור NMR עם הטווה המתאימה והעברה למגנט NMR. עכשיו לסובב את המדגם ב15-20 הרץ ולחכות עד שהמדגם מותאם לטמפרטורה שנקבע (בערך 10 דקות).
5. למזער זהירות inhomogeneity שדה מגנטי על פני מדגם על ידי התאמה על ציר ומחוץ לציר זרמי סליל פחית ^18.
6. להגדיר פרמטרים לרכישת ספקטרום NMR לערכים אופטימליים, אשר עשוי להשתנות כפונקציה של עוצמת שדה המגנט (למערכת 9.4 T, ראה לוח 1 עבור ערכי פרמטרים מומלצים).
7. מספר קבוע של עוברים לכל ניסוי (= NS).
   1. להגדיר NS כ 80 (משך זמן כולל של בערך רכישת נתונים 20 דקות) ולו רק הפרספקטיבה הנפוצה ביותר היא להיות ונרשמת עם דיוק (phosphatidylcholine (PtdCho), phosphatidylethanolamine (PtdEtn), plasmalogen ethanolamine).
   2. להגדיר NS כ 100-200 (משך זמן כולל של דרכישת אתא 1-2 hr) אם פרספקטיבה פחות המרוכזת להיות ונרשמת (אלקיל-acyl-phosphatidylcholine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, חומצת phosphatidic).
   3. להגדיר NS כ 1,500-2,000 (משך זמן כולל של רכישת נתונים 7-10 שעה; ניסוי הלילה) אם פרספקטיבה מאוד נמוך ריכוז יש ונרשמת, cardiolipin למשל מונו phosphatidylinositol וdiphosphates (PtdIP וPtdIP _2),, Lyso-הפרספקטיבה , אלקיל-acyl-phosphatidylethanolamine, ומדי פעם אחרות.
8. לאחר סיום רכישת ספקטרום, ריקבון תהליך חופשי אינדוקציה (FID) באמצעות פרמטרים אופטימליים. הערכים של פרמטרים אלה משתנים כפונקציה של כוח שדה המגנטי, איכות פחית, ואות PL לכימות.
   1. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר לטווח של קווי פרספקטיבה השלם, לחזור (לפחות שניים) נהלי סינון עיבוד באמצעות מספר רב שונים. השתמש בשיפור רזולוציה חזק לאותות חזקים חופפים, למשל., לPtdCho וPtdEtnאזורים.
   2. השתמש בסינון חזק (חלש או לא שיפור רזולוציה) לאותות חלשים.
   3. לסנן אותות חלשים מאוד ורחבים, בלי חפיפה משמעותית על ידי האפודיציה (למשל, LB = 3 הרץ) כדי להגדיל את יחס אות לרעש, לדוגמא PtdIP וPtdIP _2. ראה לוח 1 לפרמטרי עיבוד אופייניים.
9. לכמת את השטח של כל אות PL ביחס לאזור תחת האות של מתחם ההתייחסות (MDP) באותו הספקטרום.
10. לכייל את האות של מתחם ההתייחסות (MDP) בניסוי נפרד, באמצעות צינור NMR 5 מ"מ מלא בתרכובות זרחן ריכוז ידוע (i), (ii) את אותו גזע להכניס קואקסיאליים המשמש ^{ביום 31 בניסויי} P NMR PL ( לראות 7.3 ו7.9).
11. לחשב ריכוזי PL פרטניים המבוסס על אזורים יחסי של אותות PL על היד אחת (ראה 7.9), ועל ערך כיול שהתקבל לMDP מלהוסיף קואקסיאליים מאידך (ראה 7.10). קח בחשבון שמספר גרעיני זרחן תורמים לאות תמ"ג ^{ביום 31 בP} מסוימת עשוי להשתנות כפונקציה של מוצא המולקולרי של אות ש.
    הערה: אות MDP פוספונאט (בדרך כלל הפניה ל19.39 עמודים לדקה) מייצגת שני גרעיני זרחן, כפי שעושה אות פוספט cardiolipin. כל אותות NMR האחרים PL ^{31 בP} זוהו בתמציות מוח מייצגים גרעין זרחן אחת כל אחת.
12. השתמש בתוכנת סטטיסטיקה לפי צורך כדי להשוות רמות PL מוח בין קבוצות של בעלי חיים.

.8 ביצועים של ניסוי ¹ H NMR לניתוח נמסים במי מטבוליטים מוח

1. ויסות טמפרטורת סט של הבדיקה ¹ H NMR לערך היעד רצוי (בדרך כלל 25 ° C). ראו גם הדברים ב7.1.
2. צנטריפוגה פתרון התמצית המימית בצינור microcentrifuge (ראה 6.5) בשעה 4 מעלות צלזיוס ו11,000XG למשך 30 דקות לספין למטה שאריות מוצקות במדגם. העבר את 600 μl של supernatant לצינור באיכות גבוהה תמ"ג (קוטר חיצוני 5 מ"מ).
3. צינור NMR העברה למגנט NMR, פחית ופרמטרים שנקבעו ספקטרום NMR רכישה לערכים אופטימליים כפי שמוסבר ב7.4-7.6. ראה גם טבלה 1 לערכי פרמטרים מומלצים.
4. הגדר את מספר העוברים לניסוי כ NS = 32 (משך זמן כולל של בערך רכישת נתונים 13 דקות). כדי להשיג יחסי אות לרעש טובים לאותות חלשים מאוד, בעיקר באזור ארומטי, להשתמש NS = 64 (משך זמן כולל של בערך רכישת נתונים 26 דקות) או יותר.
5. לאחר סיום רכישת ספקטרום, ריקבון תהליך חופשי אינדוקציה (FID) באמצעות פרמטרים אופטימליים. הערכים של פרמטרים אלה משתנים מעט כפונקציה של כוח שדה מגנטי, איכות פחית, ואות המטבוליט לכימות.
   הערה: ברוב המקרים, זה מספיק כדי לעבד כל ספקטרום פעם אחת, מעסיק קבוצה של פרמטרים עיבוד הצגת פשרה טובה לכל אותות המטבוליט. ראה לוח 1 לפרמטרי עיבוד אופייניים.
6. לכמת את השטח של כל אות המטבוליט (לעתים קרובות multiplet, לפעמים חופף עם singlets אחר או multiplets נובעים ממולקולות שונות) ביחס לאזור תחת האות של מתחם ההתייחסות (TSP-d ₄₎ באותו הספקטרום.
7. לחשב ריכוזי המטבוליט פרטניים המבוססים על TSP-d ₄ ריכוז (ראה 6.4). קח בחשבון שמספר הפרוטונים תורמים לאות תמ"ג H ¹ מסוימת עשוי להשתנות כפונקציה של מוצא המולקולרי של אות ש. אות trimethyl TSP-d ₄ (הפניה ל0.0 עמודים לדקה) מייצגת תשעה פרוטונים.
8. השתמש בתוכנת סטטיסטיקה לפי צורך כדי להשוות רמות המטבוליט המוח בין קבוצות של בעלי חיים.

תוצאות

כדי להשיג רזולוציה הטובה ביותר בספקטרום NMR חילוף חומרים של מוח ותמציות רקמות אחרות, זה כבר זמן רב מנהג נפוץ כדי להסיר או יוני מסכת מתכת (הכי חשוב: יוני פאראמגנטיים) קיימים בפתרוני תמצית. זו הושגה על ידי הוספת סוכן chelating כגון EDTA או CDTA לתמצית ^19, או על ידי העברת התמצית...

Discussion

ספקטרוסקופיה NMR היא שיטה יעילה למדידת ריכוזים של תרכובות כימיות בפתרון בצורה מאוד לשחזור ומדויק. עם זאת, כדי לקבל נתונים באיכות גבוהה יש צורך לדבוק בכללים מסוימים הנוגעים להכנת מדגם וניתוח. בקביעת ריכוזי המטבוליט ידי ספקטרוסקופיה NMR, לא הדור ולא הקבלה של אות NMR שולטת ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15 ml, 30 ml tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor
Polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10 ml volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96% deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96% deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20% in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30% in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Research	With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913